Автореферат (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 3

Для идентификации белков,которые могут формировать детергент-устойчивые агрегаты, была использованамодификация метода PSIA, в котором для разделения и идентификации белковприменялась жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (HPLCMALDI) ( Антонец и др., 2016; Nizhnikov et al., 2014).Для анализа использовали штамм GT159 [psi-][PIN+], который трансформировалиплазмидами pUCup-Sup35Nwt-YFP и pUCup-Sup35NN-YFP.

В трансформантах с помощьюметода PSIA-HPLC-MALDI были идентифицированы 5 белков на фоне плазмиды pUCupSup35NN-YFP и 1 белок на фоне pUCup-Sup35Nwt-YFP, которые не были выявлены вконтроле (штамм GT159 [psi-][PIN+], трансформированный плазмидой pU-CUP1-YFP)(Таблица 3). В каждом случае анализ проводили в двух повторностях. Примечательно,что почти все идентифицированные белки, за исключением одного, были выявленытолько в клонах, продуцировавших Sup35NN-YFP, но не Sup35Nwt-YFP. На основанииэтих данных можно предположить, что вариант N-домена с заменой всех остатковглутамина на аспарагин обладает большой способностью к индукции амилоидогенезадругих белков, чем нативный вариант Sup35N. Такое утверждение отчасти согласуется срезультатами, полученными в работе Р.

Хафманна, согласно которым замена всехостатков глутамина на остатки аспарагина в прионном домене Sup35 ускоряла переходэтого белка в амилоидное состояние и увеличивала частоту его прионизации (Halfmann etal., 2011). Таким образом, увеличение доли аспарагина в белке приводит к усилению егоамилоидогенных свойств. Это может объясняться тем, что аспарагин имеет меньшийрадикал, по сравнению с глутамином, что позволяет полипептидным цепям сильнеесближаться и формировать β-слои.Таблица 3. Белки, формирующие агрегаты на фоне сверхпродукции Sup35Nwt-YFP иSup35NN-YFP в штамме GT159 [psi-][PIN+]Название Белок индуктор Белок индукторбелкаSup35Nwt-YFPSup35NN-YFPCtt1+Bur1+Aim39+Mad1++Acc1-+ОписаниеЗащита от оксидативного стрессаЦиклин-зависимая киназаСвязансподдержаниеммитохондриального геномаВовлечен в контроль сборки веретенаделенияАцетил-КоА карбоксилазаУ дрожжей S.

cerevisiae подавляющее большинство известных амилоидформирующих белков обогащено аспарагином и глутамином, поэтому было решенопроверить, не являются ли белки, идентифицированные методом PSIA-HPLC-MALDI,обогащенными аспарагином и глутамином.Для поиска в белковых последовательностях участков, богатых глутамином иаспарагином, существует алгоритм LPS (Harrison and Gerstein, 2003). Этот алгоритмоснован на том, что для каждого белка можно рассчитать вероятность случайногоформирования последовательности с заданным количеством остатков той или иной11аминокислоты. Участок с наименьшей вероятностью будет наиболее обогащен этойаминокислотой.

Путем перебора всех возможных участков заданной белковойпоследовательности находится такой участок, для которого эта вероятность будетнаименьшей. Однако алгоритм LPS требует больших затрат времени даже для решенияпростых задач. Нами была создана модификация этого алгоритма – SARP (Antonets andNizhnikov, 2013).В отличие от исходного алгоритма, разработанный нами алгоритм не перебираетвсе возможные фрагменты последовательности, а ищет участки фиксированной длины снаименьшей вероятностью возникновения. Затем границы таких участков расширяются,пока не будет достигнута минимальное значение вероятности. Модифицированныйалгоритм правильно находит границы всех участков, которые находит оригинальныйалгоритм, и в то же время дает выигрыш по времени работы на два порядка (Рисунок 2).Рисунок 2. Сравнениескорости работы алгоритмовLPS и SARP в зависимости отдлиныбелковойпоследовательности на входе.По горизонтали отложенынаборыбелковыхпоследовательностей,сгруппированных по длине, апо вертикали – отношениесредней скорости работыалгоритма LPS к SARP длякаждой группы белков.Мы применили разработанный нами алгоритм SARP для поиска участков, богатыхаспарагином и глутамином, у белков, выявленных с помощью PSIA-HPLC-MALDI в ходепредыдущего этапа работы.

Только у одного из 5 идентифицированных белков – у Mad1,был обнаружен участок, обогащённый аспарагином. Таким образом, сверхпродукцияSup35NN-YFP приводит к полимеризации белков, содержащих не только QN-богатыеучастки. Ранее было показано, что большинство белков, которые полимеризовались нафоне агрегации полиглутаминового домена хантингтина, содержали QN-богатые участки(Nizhnikov et al., 2014).

Преобладание QN-богатых белков в том эксперименте может бытьсвязано с тем, что полиглутаминовый домен содержит протяженный (100 аминокислот)участок, состоящий только из остатков глутамина, формирующий непрерывную бетацепь. В случае Sup35NN доля аспарагиновых остатков в (44%), по-видимому,недостаточна для того, чтобы вызывать полимеризацию преимущественно белков с QNбогатыми участками.Изучение амилоидных свойств белка Mad1. В предыдущем разделе мыпоказали, что единственный Q/N-обогащённый белок, который выявлялся методом PSIAHPLC-MALDI на фоне агрегации Sup35NN-YFP, был Mad1.

Этот белок участвует вконтроле сборки веретена деления (Chen et al., 1999; Li and Murray, 1991). Нарушениерегуляции сборки веретена деления может приводить к нестабильности поддержаниячисла хромосом (Barnhart et al., 2011). Интересно, что делеция гена MAD1 приводила кусилению токсического эффекта от агрегации α-синуклеина в дрожжевых клетках12(Willingham et al., 2003).

Мы решили детальнее исследовать амилоидные свойства этогобелка.Для оценки амилоидных свойств Mad1 мы получили плазмиды pLCup1-Mad1-CFPи pLMad1-Mad1-CFP, которые позволяют продуцировать химерный белок Mad1-CFP вдрожжах под контролем индуцибельного промотора гена CUP1 и собственногопромотора гена MAD1, соответственно.Штамм GT159 [psi-][PIN+] ко-трансформировали плазмидой pLCup1-Mad1-CFP иодной из плазмид pUCup-YFP, pUCup-Sup35Nwt-YFP или pUCup-Sup35NN-YFP.Полученные трансформанты пассировали на среде с добавлением 150 мкМ CuSO4. БелокMad1-CFP формировал глобулярные агрегаты, детектируемые при помощиконфокального микроскопа, независимо от использованного для сверхпродукцииварианта N-домена белка Sup35 (Рисунок 3А).

Важно отметить, что агрегаты белка Mad1CFP колокализовались с агрегатами белка Sup35Nwt-YFP с частотой 22,58±7,51%, в товремя как доля колокализации белка Mad1-CFP с Sup35NN-YFP составляла 61,82±6,55%.Таким образом, частота колокализации с агрегатами N-домена Sup35 с заменами нааспарагин у белка Mad1 была значимо выше (p=0,00028).Рисунок 3. Агрегация белка Mad1-CFP.

А - Агрегация белка Mad1-CFP и егоколокализация с белками Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP. CFP – канал для детекции циановогофлуоресцентного белка CFP; YFP – канал для детекции желтого флуоресцентного белка YFP;Совмещение – наложение каналов для детекции CFP, YFP и фазового контраста.

Масштабнаялинейка – 5мкм. Б - Устойчивость агрегатов Mad1-CFP к обработке додецилсульфатом натрия.Представлены результаты полуденатурирующего гель-электрофореза в агарозном геле (SDDAGE) с 1% додецил-сульфатом натрия. Верхний гель – продукция белка Mad1-CFPосуществлялась под контролем собственного промотора гена MAD1. Нижний гель – продукциябелка Mad1-CFP осуществлялась под контролем индуцибельного промотора гена CUP1 на средес добавлением 100 мкМ CuSO4. 95ºС, 60ºС, 20ºС – температура инкубации белка переднанесением пробы на гель. Sup35Nwt, Sup35NN – продукция белка Mad1-CFP осуществлялась нафоне сверхпродукции белков Sup35Nwt и Sup35NN, соответственно. Контроль – продукция белкаMad1-CFP осуществлялась на фоне контрольной плазмиды pU-CUP1.Следующим шагом являлась проверка устойчивости агрегатов Mad1 к обработкеионным детергентами додецилсульфатом натрия (SDS).

Часть химерного белка Mad1CFP присутствовала в виде устойчивых к обработке SDS олигомеров и при13сверхпродукции, и при продукции под контролем промотора гена MAD1 (Рисунок 3Б).Эти олигомеры выдерживали обработку 1% SDS как при комнатной температуре, так ипри 60ºС, независимо от того, продуцировался ли белок вместе с Sup35Nwt-YFP, Sup35NNYFP или YFP. Таким образом, белок Mad1 способен формировать амилоидоподобныеолигомеры в дрожжевых клетках.При сверхпродукции агрегаты белка Mad1-CFP колокализовались с агрегатами,формируемыми Sup35Nwt-YFP или Sup35NN-YFP в [PIN+] штамме, что можетсвидетельствовать об их коагрегации.

Включением Mad1 в более тяжелые агрегатыможно объяснить то, что с помощью PSIA-HPLC-MALDI ( Антонец и др., 2016; Nizhnikovet al., 2014) этот белок был идентифицирован только на фоне сверхпродукции Sup35NwtYFP или Sup35NN-YFP в [PIN+] штамме, но не в контроле. Можно предположить, что приподготовке проб для полуденатурирующего фореза связь Mad1 с агрегатами Sup35NwtYFP или Sup35NN-YFP разрушается, в связи с чем на форезе мы видим только олигомеры.Влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию QN-богатого фрагмента белкаGln3.

Следующим этапом нашей работы являлось изучение влияния прионов наагрегацию QN-богатых последовательностей. В качестве такой последовательности мыиспользовали богатый аспарагином и глутамином фрагмент белка Gln3 ипроанализировали влияние на его агрегацию таких хорошо изученных дрожжевыхприонов, как [PIN+] и [PSI+]. Для этого штаммы OT56 [PSI+][PIN+], 2-D-701 [PSI+][pin-],1-OT56 [psi-][PIN+] и 2-OT56 [psi-][pin-] были трансформированы плазмидой pU-CUP1GLN3QN-YFP. Фрагмент белка Gln3 с 166 по 242 аминокислоту, богатый аспарагином иглутамином, образует множественные глобулярные и точечные агрегаты не зависимо отналичия или отсутствия в штамме прионов [PSI+] и [PIN+] (Рисунок 4А).

В то же время,прионы [PSI+] и [PIN+] оказывали существенное влияние на частоту образованияфлуоресцентных фокусов Gln3QN-YFP. Наибольшая частота видимых агрегатовGln3QN-YFP детектировалась в клетках штамма [psi-][PIN+] и была значимо выше, чем востальных штаммах (p<0,01) (Рисунок 4Б). Наименьшая частота была отмечена в клеткахштамма [psi-][pin-]. Таким образом, прион [PSI+] повышает долю клеток с агрегатами QNбогатого участка Gln3 в [pin-] штаммах, но подавляет их образование в [PIN+].

Можнопредположить, что ослабление агрегации Gln3QN-YFP в штамме [PSI+][PIN+] посравнению с [psi-][PIN+] связано с тем, что агрегаты Sup35 связывают часть мономеровGln3QN-YFP, но слабее индуцируют их агрегацию, чем прионные полимеры Rnq1. Такжеагрегаты Sup35 в [PIN+] могут связывать ряд других дрожжевых белков, которые могутоказывать влияние на агрегацию Gln3QN-YFP. Наиболее сильно отличались по частотеобразования флуоресцентных фокусов белка Gln3QN-YFP штаммы [psi-][PIN+] и [psi][pin-].