Автореферат (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 2

Генотипы штаммов дрожжей охарактеризованы в соответствии состандартной трехбуквенной номенклатурой (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986). Аллельade1-14 содержит нонсенс-мутацию UGA; trp1-289 – нонсенс-мутацию UAG; ura3-52 – инсерциюдрожжевого мобильного элемента Ty1 в кодирующую часть гена URA3; leu2-3,112 – двойныемутации в гене LEU2.Плазмиды.

Плазмиды, использованные в данной работе, перечислены в таблице 2.6Таблица 2. Плазмиды, использованные в работеНазваниеpRS316ТипcenПромотор ГенМаркерURA3pRS315cenpCUP1-RNQ1CFP(LEU2)pGPD-PrP-CFPcenCUP1RNQ1-CFPLEU2cenGPDLEU2pGPDYFP(URA3)pGPD-CFP(LEU2)pRS316CGpmCUPNMsGFPcenGPDPrP(23231)-CFPYFPСсылка(Sikorski and Hieter,1989)(Sikorski and Hieter,1989)ПредоставленаС.П.Задорским (СПбГУ)(Rubel et al., 2013)URA3(Rubel et al., 2013)cencen2μGPDCUP1CUP1CFPGFPSUP35NMGFPGLN3QNYFPSUP35NMCFPLEU2URA3URA3(Rubel et al., 2013)(Serio et al., 1999)(Serio et al., 1999)LEU2Получена в настоящейработеGPDLEU2Получена в настоящейработеCUP1URA3Получена в настоящейработеpL-CUP1cenCUP1LEU2Получена в настоящейработеpU-CUP1-YFPcenCUP1YFPURA3Получена в настоящейработеpL-CUP1-CFPcenCUP1YFPLEU2Получена в настоящейработеpUCup-Sup35Nwt cenCUP1SUP35Nwt URA3Получена в настоящейработеpUCup-Sup35NNcenCUP1SUP35NNURA3Получена в настоящейработеpUCup-Sup35NFcenCUP1SUP35NFURA3Получена в настоящейработеpUCupcenCUP1SUP35Nwt- URA3Получена в настоящейSup35Nwt-YFPYFPработеpUCup-Sup35NN- cenCUP1SUP35NN- URA3Получена в настоящейYFPYFPработеpUCup-Sup35NF- cenCUP1SUP35NFURA3Получена в настоящейYFPYFPработеpLCup-Mad1cenCUP1MAD1LEU2Получена в настоящейCFPCFPработеpLMad1-Mad1cenMAD1MAD1LEU2Получена в настоящейCFPCFPработеПримечание.

cen – центромерная плазмида, 2μ – многокопийная плазмида. Все плазмидыв таблице содержат ген устойчивости к ампициллину для селекции в E. coli.pU-CUP1cenGLN3QN-YFPpGPD-SUP35NM- cenCFPpU-CUP1cenCUP1URA3Генетические методы. В работе были использованы стандартные генетическиеметоды работы с дрожжами: метод селективных сред для проверки ауксотрофностиштаммов, метод отпечатков, метод посева истощающим штрихом (Захаров и др., 1984;Инге-Вечтомов, 1971; Rose et al., 1990).

Проверка потери фенотипа Ade+ (рост на7селективной среде без аденина) на среде с хлоридом гуанидина осуществляласьтрехкратным пассированием на твердой среде YAPD с добавлением 5 мМ хлоридагуанидина “QIAGEN” (США). Для оценки частоты индукции фактора [PSI+] в штаммеGT159, трансформированном плазмидами pUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NN-YFPили pUCup-Sup35NF-YFP, проводили тест на разведение. Для оценки частоты индукциииспользовали отношение количества клонов, выросших на среде без аденина кколичеству клонов, выросших на среде с добавлением аденина.Молекулярно-биологические методы.

Трансформацию бактерий E. coli проводилипо стандартной методике (Inoue et al., 1990). Трансформацию дрожжей такжеосуществляли по стандартной методике с использованием ацетата лития (Rose et al.,1990). Выделение плазмидной ДНК из бактерий проводили методом щелочного лизиса(Sambrook et al., 1989). Выделение геномной ДНК из дрожжей проводили по методике,предложенной Lõoke et al., 2011. Клеточный лизат дрожжей получали с помощью методаразрушения клеток стеклянными шариками (Newnam et al., 1999).

Для оценки размераагрегатов белков, а также анализа их устойчивости к действию детергентов использовалиметод полуденатурирующего белкового электрофореза в агарозном геле (SDD-AGE)(Bagriantsev et al., 2006; Kryndushkin et al., 2003) с модификациями.Конфокальная микроскопия. Анализ агрегации и колокализации белков, слитых ссиним флуоресцентным белком CFP и желтым флуоресцирующим белком YFP,проводили при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCSSP5 “Leica Microsystems GmBH” (Германия) (Центр коллективного пользования СПбГУ«Хромас») и лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 MP“Leica Microsystems GmBH” (Германия) (Ресурсный центр СПбГУ «Развитиемолекулярных и клеточных технологий»).

Для CFP использовали возбуждающий лазер458 нм, запирающий фильтр 462-510 нм, для YFP – возбуждающий лазер 514 нм,запирающий фильтр 518-580 нм, для DAPI – возбуждающий лазер 405 нм, запирающийфильтр 425-475 нм.Протеомный скрининг и идентификации амилоидов. Протеомный скрининг иидентификацию амилоидов с использованием высокоэффективной жидкостнойхроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, (PSIA-HPLC-MALDI) проводили всоответствии с описанной ранее методикой (Антонец и др., 2016; Nizhnikov et al., 2014).Статистические методы. Доверительный 95% интервал для доли вычисляли постандартной формуле (Newcombe, 1998). Для сравнения частот индукции использовалинепараметрический метод Крускала-Уоллиса (Kruskal and Wallis, 1952) с попарнымсравнением с помощью теста Данна (Dunn, 1964). Для сравнения долей клеток сагрегатами, частот колокализации и количества клонов, потерявших фенотипа Ade+,использовали множественное попарное сравнение точным тестом Фишера (Fisher, 1932).Для множественных попарных сравнений значение p получали с использованиемпоправки по методу Бенжамини и Хохберга (Benjamini and Hochberg, 1995).Доверительный 95% интервал для отношения скоростей работы алгоритмов вычислялипо методу, предложенному Хаслером (Hasler and Hothorn, 2008).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕАнализ амилоидогенных свойств вариантов N-терминального домена Sup35 сзаменами глутамина на аспарагин и фенилаланин.

Для изучения ролипоследовательностей, богатых аспарагином и глутамином (QN-богатых), вамилоидогенезе мы использовали способность дрожжевого белка Sup35 формироватьамилоиды при переходе в прионное состояние [PSI+]. Были получены плазмиды pUCupSup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NN-YFP и pUCup-Sup35NF-YFP для сверхпродукции в8дрожжевых клетках нативного N-домена белка Sup35 (Sup35Nwt), N-домена, в которомвсе остатки глутамина заменены на остатки аспарагина (Sup35NN), и N-домена с заменойвсех остатков глутамина на фенилаланин (Sup35N F). Изогенные штаммы дрожжей S.cerevisiae GT159 [psi-][PIN+] и GT174 [psi-][pin-] были трансформированы этимиплазмидами.

В штамме [PIN+] все варианты N-домена белка Sup35 формировалиагрегаты, детектируемые при помощи лазерного сканирующего конфокальногомикроскопа. Белок Sup35NN-YFP, как и Sup35Nwt-YFP, формировал точечные илентообразные агрегаты, а Sup35NF-YFP – точечные и глобулярные (Рисунок 1А). Вштамме [pin-] Sup35NF-YFP формировал агрегаты, тогда как Sup35NN-YFP и нативныйвариант N-домена, слитый с YFP, были равномерно распределены по цитоплазмедрожжевых клеток. Стоит отметить, что белок Sup35NF-YFP формировал точечные илиглобулярные агрегаты, как правило, один на клетку, как в [pin-], так и в [PIN+] штаммах(Рисунок 1А). С помощью метода полуденатурирующего гель-электрофореза в агарозномгеле (SDD-AGE) было показано, что в штамме [PIN+] Sup35NN-YFP образует полимеры,устойчивые к обработке детергентом додецилсульфатом натрия, аналогично Sup35NwtYFP (Рисунок 1Б).

В штамме [pin-] нативный N-домен и N-домен с заменами глутаминана аспарагин присутствовали только в мономерной форме. Sup35NF-YFP формировалдетергент-устойчивые олигомеры в [pin-] и в [PIN+] штаммах, но они были существеннолегче, чем агрегаты Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP. В целом, полученные результатыпозволяют говорить о том, что варианты N-домена с заменами глутамина на аспарагин ифенилаланин могут формировать амилоидоподобные агрегаты в дрожжевых клетках.Отсутствие различий по агрегации Sup35NF-YFP в [pin-] и [PIN+] может объясняться тем,что такой вариант N-домена Sup35 не взаимодействует с агрегатами Rnq1 и является[PIN+]-независимым.Мы решили проверить, будут ли варианты N-домена Sup35 с заменами глутаминана аспарагин или фенилаланин индуцировать состояние [PSI+] у белка Sup35 дикого типа(Sup35WT). С этой целью штамма GT159 [psi-][PIN+] трансформировали плазмидамиpUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NN-YFP, pUCup-Sup35NF-YFP или pUCup-YFP(отрицательный контроль).

Трансформантов пассировали на среде с добавлением CuSO4до концентрации 150 мкМ для сверхпродукции соответствующих белков. Затем дрожживысевали серией последовательных десятикратных разведений на среду, не содержащуюаденин, для селекции клонов, в которых произошла индукция фактора [PSI+]. В четырехповторностях было показано, что сверхпродукция белка Sup35NN-YFP приводила кпоявлению клонов c Ade+ фенотипом с большей частотой (р=0,043), чем в отрицательномконтроле (Рисунок 1В). В то же время, эта частота была меньше, чем на фонесверхпродукции белка Sup35Nwt-YFP. Стоит отметить, что сверхпродукция N-доменаSup35 с заменой всех остатков глутамина на аспарагин в штамме с полноразмернымSup35 с таким же N-доменом приводит к более высокой частоте индукции [PSI+], чемсверхпродукция нативного N-домена в штамме с Sup35WT(Halfmann et al., 2011).

Такимобразом, уменьшение количества индуктантов Sup35WT при сверхпродукции Sup35NNYFP по сравнению со сверхпродукцией Sup35Nwt-YFP связано с тем, что агрегатыSup35NN-YFP хуже взаимодействуют с Sup35WT, или такое взаимодействие режеприводит к прионной конверсии Sup35WT. Клоны, трансформированные плазмидойpUCup-Sup35NF-YFP, не отличались от отрицательного контроля. Важно отметить, чтоклоны с фенотипом Ade+, полученные при сверхпродукции Sup35Nwt-YFP и Sup35NNYFP, теряли этот фенотип при пассировании на среде с хлоридом гуанидина, что являетсяодним из свойств приона [PSI+]. Таким образом, N-домен Sup35 с заменами глутамина нафенилаланин не способен индуцировать прион [PSI+] у нативного Sup35, а вариант сзаменами на аспарагин индуцирует [PSI+], хотя и менее эффективно, чем Sup35Nwt.9Рисунок 1.

Особенности сверхпродукции белков Sup35Nwt-YFP, Sup35NN-YFP иSup35NF-YFP в клетках дрожжей. А - Агрегация белков Sup35Nwt-YFP, Sup35NN-YFP иSup35NF-YFP в штаммах [pin-] и [PIN+]. YFP – канал для детекции желтого флуоресцентногобелка YFP; ФК – фазовый контраст; Совмещение – наложение каналов YFP и фазового контраста.Масштабная линейка –5мкм.

Б - Устойчивость к обработке додецил-сульфатом натрия агрегатов,формируемых белками Sup35Nwt-YFP, Sup35NN-YFP и Sup35NF-YFP в штаммах [pin-] и [PIN+].(К) – кипяченый белок; (Н) – не кипяченый белок. В - Индукция Ade+ клонов в тестах наразведение после сверхпродукции разных вариантов N-домена Sup35.На основании полученных результатов можно заключить, что сходствоаминокислотных остатков в составе амилоидогенных последовательностейвзаимодействующих белков является важным фактором для кросс-индукцииамилоидогенеза.Изучение влияния аминокислотных замен в N-домене Sup35 на индукциюамилоидогенеза других белков в протеоме дрожжей. Сверхпродукция амилоидогенныхбелков с последовательностями, богатыми аспарагином и глутамином, может вызыватьагрегацию других белков.

Например, ранее в лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна былопоказано, что сверхпродукция в дрожжах S. cerevisiae фрагмента белка хантингтина,содержащего протяженный полиглутаминовый участок, вызывала агрегацию рядадрожжевых белков с QN-богатыми участками (Nizhnikov et al., 2014). Мы решили10проверить, не вызывает ли сверхпродукция Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP сходныйэффект. Были взяты варианты N-домена Sup35Nwt и Sup35NN, так как онивзаимодействуют с двумя дрожжевыми NQ-богатыми прионами. Rnq1 в прионной формеиндуцирует их агрегацию, а агрегация Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP, в свою очередь,индуцирует переход белка Sup35 в прионное состояние.