Автореферат (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 4

Различие в агрегации Gln3QN-YFP между этими штаммами было такжеподтверждено с помощью ультрацентрифугирования клеточных лизатов, выделенных изэтих штаммов, с последующей Вестерн-блот гибридизацией. В штамме [PIN+] большебелка Gln3QN-YFP детектируется в осадочной фракции, в то время как в штамме [pin-]этот белок находится в основном в надосадочной фракции (Рисунок 4В). ПолимерыGln3QN-YFP, образующиеся во всех проанализированных штаммах, устойчивы кобработке детергентом лаурилсаркозинатом натрия (Рисунок 4Г), хотя и не устойчивы кобработке SDS. Таким образом, прионы [PSI+] и [PIN+] не оказывают эффекта ни наспособность QN-богатого участка Gln3 агрегировать, ни на биохимические свойстваобразующихся агрегатов, но существенно влияют на частоту формирования агрегатов.14Рисунок 4.

Агрегация белка Gln3QN-YFP. А – Белок Gln3QN-YFP формирует агрегатынезависимо от прионов [PIN+] и [PSI+]. DAPI – канал для детекции DAPI, красителя, специфичносвязывающегося с ДНК и маркирующего ядро; Gln3QN-YFP – канал для детекции YFP, всештаммы продуцируют белок Gln3QN-YFP, поэтому на этом канали детектируется именно он;Совмещение – наложение каналов для детекции DAPI, YFP и фазового контраста. Масштабнаялинейка – 5мкм (Антонец и др., 2016).

Б – Процент клеток с агрегатами Gln3QN-YFP зависит отстатуса [PIN+] и [PSI+]. (p<0.01) означает, что процент клеток с агрегатами в данных штаммахразличается на уровне значимости 0,01 (Антонец и др., 2016). В – Сравнение агрегации белкаGln3QN-YFP в штаммах [psi-][PIN+] и [psi-][pin-] с помощью ультрацентрифугированияклеточных лизатов. Т – тотальный лизат – лизат, не подвергавшийся разделению на фракции спомощью ультрацентрифугирования; Н – надосадочная фракция клеточного лизата; О –осадочная фракция клеточного лизата. Г – Gln3QN-YFP образует агрегаты, устойчивые кобработке лаурил-саркозинатом натрия, независимо от дрожжевых прионов [PIN+] и [PSI+](Антонец и др., 2016).Прионы [PSI+] и [PIN+] влияют на частоту формирования флуоресцентных фокусовGln3QN-YFP, поэтому можно было предположить, что этот эффект опосредованвзаимодействием Gln3QN-YFP со структурными белками этих прионов: Sup35 для [PSI+]и Rnq1 для [PIN+].

Для проверки этой гипотезы штаммы OT56 [PSI+][PIN+], 2-D-701[PSI+][pin-], 1-OT56 [psi-][PIN+] и 2-OT56 [psi-][pin-] были ко-трансформированыплазмидой pU-CUP1-GLN3QN-YFP, а также плазмидой для сверхпродукции прионформирующего участка Sup35, слитого с CFP (pCUP1-SUP35NM-CFP), или плазмидойдля сверхпродукции Rnq1, слитого с CFP (pCUP1-RNQ1-CFP(LEU2)). Флуоресцентныефокусы Gln3QN-YFP колокализуются с фокусами белка Rnq1-CFP с частотой, близкой к100% во всех проанализированных штаммах [PIN+] (Рисунок 5А и Б).

В штаммах [pin-]белок Rnq1-CFP образует видимые агрегаты крайне редко, и анализ колокализации в нихневозможен. Хотя агрегаты Gln3QN-YFP колокализуются и с агрегатами белка Sup35NMCFP в штаммах [PSI+][PIN+], [PSI+][pin-] и [psi-][PIN+] (в штамме [psi-][pin-] Sup35NM-CFPне агрегирует), но частота колокализации этих белков не превышает 50% (Рисунок 5Б иВ). Это согласуется с данными о том, что прион [PSI+], хотя и влияет на частоту агрегатовGln3QN-YFP, но не так сильно, как прион [PIN+].

Таким образом, несмотря на то, чтоагрегаты Gln3QN-YFP выявляются даже в штамме [psi-][pin-], прион [PIN+] оказываетзначительное влияние на агрегацию Gln3QN-YFP. В то же время [PSI+] являетсямодификатором эффекта [PIN+]. Последний существенно увеличивает частоту появленияагрегатов Gln3QN-YFP, а [PSI+], в свою очередь, подавляет эффект [PIN+].15Рисунок 5. Колокализация агрегатов белка Gln3QN-YFP с Rnq1-CFP и Sup35NMCFP (Антонец и др., 2016). А - Агрегаты Gln3QN-YFP колокализуются с агрегатами белка Rnq1CFP в [PIN+] штаммах. Gln3QN-YFP – канал для детекции YFP, все штаммы продуцируютGln3QN-YFP; Rnq1-CFP – канал для детекции CFP, все штаммы продуцируют белок Rnq1-CFP;Совмещение – наложение каналов YFP, CFP и фазового контраста. Масштабная линейка – 5мкм.Б - Доля клеток, в которых наблюдается колокализация агрегатов Gln3QN-YFP с Sup35NM-CFPили Rnq1-CFP.

(p<0.05) означает, что процент клеток с агрегатами в данных штаммах различаетсяна уровне значимости 0,05. В - Агрегаты Gln3QN-YFP частично колокализуются с агрегатамиSup35NM-CFP. Gln3QN-YFP – канал для детекции YFP, все штаммы продуцируют белокGln3QN-YFP; Sup35NM-CFP – канал для детекции CFP, все штаммы продуцируют Sup35NMCFP; Совмещение –наложение каналов YFP, CFP и фазового контраста.

Масштабная линейка –5мкм.В целом, нами было показано, что агрегация QN-богатого участка белка Gln3сильно зависит от сочетания дрожжевых прионов [PSI+] и [PIN+], а также, что прион[PIN+] является более сильным индуктором агрегации Gln3QN, чем прион [PSI+].ЗАКЛЮЧЕНИЕРабота посвящена изучению факторов, влияющих на амилоидогенез QN-богатыхбелковых последовательностей, и анализу эффекта этих последовательностей наиндукцию амилоидогенеза других белков.

Прионы [PSI+] и [PIN+] усиливают агрегациюфрагмента белка Gln3, богатого аспарагином и глутамином. [PIN+] является болеесильным индуктором агрегации, чем прион [PSI+]. Несмотря на то, что в [pin-] штамме[PSI+] усиливал агрегацию Gln3QN-YFP, в [PIN+] штамме присутствие [PSI+] приводило16к снижению частоты формирования агрегатов Gln3QN-YFP. Двойственный эффект [PSI+]интересен, и требует дальнейших исследований.Влияние QN-богатых последовательностей на амилоидогенез было рассмотрено врамках изучения эффекта разных вариантов N-домена Sup35 на индукцию приона [PSI+]и индукцию амилоидогенеза других дрожжевых белков.

Вариант N-домена Sup35 сзаменой всех остатков глутамина на аспарагин был способен индуцировать переходполноразмерного белка Sup35WT в прионное состояние, несмотря на замену 28%аминокислотных остатков. Вариант N-домена Sup35 с заменой всех остатков глутаминана фенилаланин не индуцировал прион [PSI+] и агрегировал независимо от наличияфактора [PIN+]. Таким образом, сходство свойств аминокислотных остатков в составеамилоидогенных последовательностей взаимодействующих белков является важнымфактором для кросс-индукции амилоидогенеза.Агрегация белка Sup35NN-YFP с бóльшим содержанием аспарагина, чем вSup35Nwt-YFP, способствовала полимеризации бóльшего количества белков, из которыхтолько один Mad1 содержал участок, богатый аспарагином. Эти данные указывают на то,что замена глутамина на аспарагин в амилоидогенных трактах приводит к усилениюспособности этих последовательностей индуцировать амилоидогенез других белков.ВЫВОДЫ1.

Варианты N-домена белка Sup35 с заменами глутамина на аспарагин и нафенилаланин формируют амилоидоподобные агрегаты в дрожжевых клетках.2. Сходство свойств аминокислотных остатков в составе амилоидогенныхпоследовательностей взаимодействующих белков способствует кросс-индукцииамилоидогенеза.3.

Замены глутамина на аспарагин усиливают способность прионного домена Sup35индуцировать агрегацию других белков.4. Белок Mad1 формирует амилоидоподобные детергент-устойчивые олигомеры вдрожжевых клетках.5. Разработанбиоинформатическийалгоритмпоискапоследовательностей,обогащённых амилоидогенными аминокислотами, который обеспечивает выигрышпо времени работы на 2 порядка по сравнению с исходным алгоритмом LPS.6.

Прион [PIN+] усиливает агрегацию богатого аспарагином и глутамином участка белкаGln3.СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИСтатьи:1. Антонец К.С., Волков К.В., Мальцева А.Л., Аршакян Л.М., Галкин А.П., НижниковА.А. Протеомный анализ белковых фракций бактерии Escherichia coli, устойчивых ксолюбилизации ионными детергентами // Биохимия, 2016, Т.81, С.92-105.2. Антонец К.С., Саргсян А.М., Нижников А.А. Q/N-обогащенный фрагмент Gln3 вотличие от полноразмерного белка агрегирует при сверхпродукции в клеткахSaccharomyces cerevisiae // Биохимия, 2016, Т.81, С.555-5623.

Нижников А.А., Антонец К.С., Инге-Вечтомов С.Г. Амилоиды: от патогенеза кфункции // Биохимия, 2015 Т.80, С.1356-1375.4. Antonets K.S., Nizhnikov A.A. SARP: a novel algorithm to assess compositional biases inprotein sequences // Evolutionary Bioinformatics, 2013, V.9, P.263-273.17Тезисы конференций:1. Антонец К.С., Нижников А.А., Галкин А.П. Роль аспарагин/глутамин-обогащенныхпоследовательностей в индукции амилоидогенеза // Всероссийская конференция «50лет ВОГиС: успехи и перспективы» (2016, Москва, Российская Федерация), Сборниктезисов, 2016, Т.1, С.71.2.