Автореферат (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae)

На правах рукописиАнтонец Кирилл СергеевичИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, БОГАТЫХАСПАРАГИНОМ И ГЛУТАМИНОМ, В ИНДУКЦИИАМИЛОИДОГЕНЕЗА У ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiaeспециальность: 03.02.07. – генетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург2017Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Университете накафедре генетики и биотехнологии.Научный руководитель:доктор биологических наукГалкин Алексей ПетровичЗаместитель директора по научным вопросамСанкт-Петербургского филиалаФедерального государственного бюджетного учреждения науки«Институт общей генетики им Н.И.

Вавилова» Российской академии наук,г. Санкт-ПетербургОфициальные оппоненты:доктор биологических наукСаранцева Светлана ВладимировнаЗаместитель директора по научным вопросам Федерального государственногобюджетного учреждения «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова» НИЦ «Курчатовский институт», г. Гатчинакандидат биологических наукМихайлова Екатерина ВячеславовнаНаучный сотрудник группы генетики митозаФедерального государственного бюджетного учреждения науки «ИнститутЦитологии» Российской академии наук,г.

Санкт-ПетербургВедущее учреждение:Федеральное государственноебюджетное образовательное учреждение высшегообразования Московский государственныйуниверситет имени М.В. Ломоносова, Москва.Защита диссертации состоится “ “2017 г. вчасов на заседаниисовета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций приСанкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 СанктПетербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биологический факультет, кафедрагенетики и биотехнологии, аудитория .С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М.Горького Санкт-Петербургского Государственного университета и на веб-сайтеСПбГУ(https://disser.spbu.ru/disser/soiskatelyu-uchjonoj-stepeni/dislist/details/14/1243.html).Автореферат разослан “ “2017 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д.212.232.12доктор биологических наукЛ.А.

Мамон3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемы. Амилоиды представляют собой белковые фибриллы,стабилизированные кросс-β-слоями (по: Greenwald and Riek, 2010). Изначальноформирование амилоидов связывали только с патологическими процессами (по:Нижников и др., 2015). К настоящему времени показано, что более 30 заболеванийчеловека, многие из которых неизлечимы, ассоциировано с образованием амилоидов (по:Sipe et al., 2014).

Однако, сравнительно недавно было показано, что амилоидогенез связанне только с патологией, но и играет существенную роль в физиологических процессах усамых разных организмов (по: Нижников и др., 2015). Так, амилоиды необходимы дляформирования биопленок у бактерий (Chapman, 2002) и архей (Chimileski et al., 2014),воздушных гифов у грибов (Wösten and Vocht de, 2000), запасания гормонов (Maji et al.,2009) и синтеза меланина (Fowler et al., 2006) у человека, а также вовлечены в еще целыйряд процессов. Стоит отметить, что список функциональных амилоидов продолжаетпостоянно расширяться.Важным этапом в изучении амилоидов было открытие инфекционных амилоидов– прионов (Bolton et al., 1982), изначально выявленных у млекопитающих, но позжеобнаруженных у одноклеточных грибов – дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Wickner,1994). Последовательности подавляющего большинства дрожжевых прионных белковсодержат участки, богатые аспарагином (N) и глутамином (Q).

Показано, что эти участкинеобходимы для формирования амилоидных фибрилл и эволюционно консервативны (Anet al., 2016; Toombs et al., 2010). Известно, что наличие амилоидных агрегатов одногобелка может провоцировать агрегацию других белков, или иначе говоря, кросс-индукциюамилоидогенеза. Механизмы таких взаимодействий изучены недостаточно. Богатыеаспарагином и глутамином участки белков также вовлечены в кросс-индукциюамилоидогенеза (Derkatch et al., 2001; Derkatch et al., 2004), однако влияниеаминокислотного состава взаимодействующих белков на этот процесс неясно.Настоящее диссертационное исследование посвящено изучению роли участков,богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза на моделях прионногодомена белка Sup35 (Ter-Avanesyan et al., 1994) и NQ-обогащенного участкатранскрипционного фактора Gln3 (Alberti et al., 2009).

Поскольку кросс-индукцияамилоидогенеза зачастую связана с развитием патологий, исследование актуально как сфундаментальной, так и с прикладной точки зрения.Степень разработанности темы. На текущий момент накоплен значительныйобъем данных о прионах дрожжей (по: Нижников и др., 2015), структуре амилоидов (по:Riek, 2016), роли богатых аспарагином и глутамином участков в амилоидогенезе(Derkatch et al., 2004; Toombs et al., 2010), а также о взаимодействии некоторыхдрожжевых прионов (Derkatch et al., 2001). В то же время, роль аминокислотного составабелков в регуляции индукции амилоидогенеза на данный момент изучена недостаточнохорошо.

Получение новых данных о влиянии богатых аспарагином и глутаминомамилоидов на агрегацию других белков в масштабах всего протеома имеетфундаментальное и потенциально прикладное значение.Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение ролипоследовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза удрожжей Saccharomyces cerevisiae.В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:1.

Провести сравнительный анализ амилоидогенных свойств нативного N-доменаSup35 и его модифицированных вариантов, у которых все глутаминовыеостатки замещены на аспарагиновые или фенилаланиновые.42. Выявить в протеоме дрожжей белки, агрегация которых индуцируется вприсутствии нативного N-домена Sup35 и его модифицированного варианта, укоторого все глутаминовые остатки замещены на аспарагиновые.3. Охарактеризовать влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию богатогоаспарагином и глутамином домена белка Gln3.Научная новизна. В ходе данной работы впервые были изучены амилоидныесвойства двух вариантов N-домена белка Sup35, у которых все остатки глутаминазамещены на остатки аспарагина или фенилаланина.

Также изучена способность этихвариантов индуцировать фактор [PSI+]. Показано влияние аминокислотного состава навзаимодействие амилоидогенных белков. Выявлен ряд белков, агрегация которыхиндуцируется сверхпродукцией нативного N-домена Sup35 и его модифицированноговарианта, у которых все глутаминовые остатки замещены на аспарагиновые.

Разработанновый алгоритм поиска последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, insilico. Охарактеризованы амилоидоподобные свойства олигомеров белка Mad1. Показановлияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию богатого аспарагином и глутамином доменабелка Gln3.Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в ходе даннойработы результаты вносят вклад в понимание механизмов индукции и регуляцииамилоидогенеза.

Впервые показано, что сходство аминокислотного составаамилоидогенных трактов влияет на кросс-индукцию амилоидогенеза. Установлено, чторазличие свойств аминокислотных остатков в составе амилоидогенных трактовпрепятствует взаимодействию белков. Показано, что замены глутамина на аспарагинусиливают способность прион-формирующего белка индуцировать агрегацию другихбелков. Выявление закономерностей, определяющих «каскады амилоидогенеза», вперспективе может иметь важное значение для разработки подходов к лечениюамилоидных заболеваний.Методология и методы исследования. В ходе выполнения работы былииспользованы стандартные генетические и молекулярно-биологические методыисследований. Был использован широкий ряд молекулярно-генетических методов (генноинженерные методы клонирования генов и конструирования плазмид, полимеразнаяцепная реакция, трансформация дрожжевых и бактериальных клеток), методы лазернойсканирующей конфокальной микроскопии, выделения белка, белкового электрофореза вполиакриламидном и агарозном геле, Вестерн-блот и ряд статистических методов.

Висследовании был применен разработанный на кафедре генетики и селекции СПбГУметод протеомного скрининга и идентификации амилоидов с использованиемвысокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, атакже разработан и применен биоинформатический алгоритм для выявления участковбелков, обогащенных аспарагином и глутамином.Положения, выносимые на защиту.

На основании экспериментов по заменеаминокислотных остатков в прионном домене белка Sup35 мы показали, что сходствосвойств аминокислотных остатков в составе взаимодействующих амилоидогенныхпоследовательностей является важным фактором для кросс-индукции амилоидогенеза.Установлено, что замена глутамина на аспарагин в амилоидогенных трактах приводит кусилению способности этих последовательностей индуцировать амилоидогенез другихбелков.

Разработанный нами биоинформатический алгоритм для выявленияпоследовательностей, обогащённых амилоидогенными аминокислотами, существеннопревосходит имеющиеся аналоги по скорости работы.Степень достоверности и апробация результатов. Полученные в ходе даннойработы результаты являются достоверными, что подтверждается их публикацией в 45научных статьях в рецензируемых журналах и 6 тезисных сообщениях. Материалыработы были представлены на ряде Всероссийских и международных конференций:«Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 50-летиюВавиловского (ранее Всесоюзного) Общества генетиков и селекционеров», (2016,Москва, Российская Федерация); “International Symposium on Cognitive Sciences,Genomics and Bioinformatics” (CSGB 2016) (2016, Новосибирск, Российская Федерация);международный конгресс “Prion 2016” (2016, Токио, Япония); “27th InternationalConference on Yeast Genetics and Molecular Biology” (2015, Левико-Терме, Италия); «VIСъезд Вавиловского Общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированныхгенетических симпозиумов» (2014, Ростов-на-Дону, Российская Федерация); “ The NinthInternational Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/SystemsBiology” (BGRS-2014) (2014, Новосибирск, Российская Федерация).Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 138 страницах ивключает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы»,«Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Втексте представлено 27 рисунков и 8 таблиц. Список литературы содержит 283 источника.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫШтаммы S. cerevisiae и E. coli. В работе использовали штамм бактерии Escherichiacoli DH5α, следующего генотипа: supE44 ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1gyrA96 thi-1 elA1 (Hanahan, 1985). Генотипы штаммов дрожжей S. cerevisiae,использованные в работе, приведены в таблице 1.Таблица 1. Штаммы S. cerevisiae, использованные в работеШтаммГенотип, прионные детерминантыСсылкаOT56MATa ade1-14UGA his3 leu2 trp1-289UAG(Derkatch et al., 1996)++ura3 [PSI ][PIN ]1-OT56MATa ade1-14UGA his3 leu2 trp1-289UAG(Matveenko et al., 2016)+ura3 [psi ][PIN ]2-OT56MATa ade1-14UGA his3 leu2 trp1-289UAG(Matveenko et al., 2016)ura3 [psi ][pin ]9-10-7AMATα ade1-14UGA his7-1 leu2 lys2 trp1(Бондарев и др., 2017)D832ura3SUP35::TRP1RNQ1::KanMX[pYCM-U2- SUP35] [PSI+][pin-]2-D-701MATα ade1-14UGA trp1 leu2 ura3 lys2Получен в настоящей работе[PSI+][pin-]GT159MATa ade1-14UGA his3 trp1Δ leu2 ura3(Chernoff et al., 1999)lys2 [psi-][PIN+]GT174MATa ade1-14UGA his3 trp1Δ leu2 ura3(Chernoff et al., 1999)lys2 [psi-][ pin-]Примечание.