Диссертация (Молекулярная характеристика продуцентов карбапенемаз семейства Enterobacteriaceae, выделенных в Санкт-Петербурге), страница 11

глицерина (на этой стадии 10%глицерин должен быть чистым)10.Вносились аликвоты в заранее охлаждённые пробирки по 20 мкл. исразу замораживались в жидком азоте.Электропорация1. Готовились пробирки со средой SOC (по 1 мл)2. Оттаивались на льду клетки и ДНК613. Охлаждались на льду кюветы электропоратора4. Вносились в кювету электропоратора 20 мкл. суспензии клеток и 1мкл.

ДНК5. Проводилась электропорация6. Быстро вносилась суспензия клеток в 1 мл. среды SOC7. Пробирку с электротрансформантами ставили на качалку (1 час при37 0С)8. Осаждали клетки в эппендорфе при 4000 g 5 минут9. Осадок ресуспензировали и вносили на селективную средуТрансконъюгация1. Выращивался ночной инокулюм реципиента E. coli C600 AzRRifR всреде LB при 370С на качалке, аналогично выращивался инокулюмдонора.2.

Инокулюм разводился 1:50 в LB, после чего опять выращивался при370С до ОП=0,6 (при длине волны 610 нм).3. Суспензия клеток донора ставилась на 30 минут при комнатнойтемпературе, а реципиента на 15 минут при 42 0С4. Суспензии клеток смешивали в соотношении 1:10 с избыткомреципиента, после чего суспензия осаждалась на фильтре5. Фильтр помещали на чашки Петри со средой LB (клетками вверх),инкубируется при 370 С ночь6. С фильтра смывалась клеточная суспензия в среде LB, после чегопроизводился посев на селективную среду для трансконъюгантов.2.5.

Обработка результатов исследованияВсе полученные в ходе исследования результаты были анализированы спомощью следующего программного обеспечения: Microsoft «Excel» 2007(составлениебазыданных),WHOnet5.6(анализрезультатов62антибиотикочувствительности), UniproUgene,Vector NTI, SnapGene,Geneious (работа с нуклеотидными последовательностями).63Глава 3. Результаты исследования3.1 Оптимизация метода детекции карбапенемазной активностиграмотрицательных бактерий с помощью MALDI-TOF массспектрометрии и методов молекулярной детекции генов карбапенемазСуществует два принципиальных подхода к детекции карбапенемазнойактивности: фенотипический и молекулярный.

Фенотипический подходоснован на явлении разрушения карбапенемного антибиотика штаммомпродуцентом карбапенемазы, наиболее распространенные варианты этомодифицированный тест Ходжа (МТХ), не отличающийся высокимипоказателями чувствительности и специфичности, а также методы на основемасс-спектрометрии. Методы на основе масс-спектрометрии, к которымотноситсяприведённыйнижепротокол,превосходятМТХпочувствительности, специфичности, а также скорости проведения анализа –менее трёх часов при наличии чистой культуры, но требует дорогогооборудования – масс-спектрометра. Методы на основе ПЦР обладаютмножеством преимуществ (высокая скорость проведения анализа, высокаястепень стандартизации, чувствительность), но и рядом недостатков.Большое число известных генов карбапенемаз делает их рутинный скринингзатруднительным из-за необходимости постановки большого числа ПЦРреакций,акарбапенемаз.такжеметодВнедрениеневпозволяетпрактикуобнаруживатьметодовновыегеныфенотипическойимолекулярной детекции карбапенемаз - необходимый этап для их изучения иконтроля их распространения.3.1.1 Оптимизация метода детекции карбапенемазной активностиизолятов с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрииДля детекции карбапенемазной активности с помощью MALDI-TOF массспектрометрии, на основе литературных данных, был разработан иапробирован следующий протокол исследования:641.

Готовится свежий раствор лекарственной формы субстанциимеропенема 200 мкг/мл в 0,9% NaCl (массовая доля меропенема всубстанции 85%)2. Готовится суспензия тестируемого штамма V=1 мл. ОП 4 - 4.20 пошкале McFarland, после чего клетки осаждаются центрифугированиемпри 7 тыс. об. 7 минут и супернатант удаляется3. К осаждённым клеткам вносится 15 мкл. раствора антибиотика исодержимое пробирки ресуспензируется на вортексе4. Смесь клеток и раствора антибиотика культивируются при температуре37о С 2,5 часа, после чего пробирка снова центрифугируется и 2 мкл.супернатанта переносятся на плашку масс-спектрометра5.

Детекция масс-спектров проводится в диапазоне 280-520 Da6. При отсутствии пика, соответствующего нативной форме меропенема(384 Da), результат считается положительным7. Важно включать в анализ следующие контроли:А) Раствор 0,9% NaClБ) Раствор меропенема из пункта 1.В) Тест со штаммом, обладающим валидированной карбапенемазнойактивностьюГ) Тест со штаммом, не обладающим карбапенемазной активностьюВ основе метода лежит детекция разрушения нативной (исходной)формы молекулы меропенема и образования гидролизованного продукта(Рис.4).Пригидролизепроисходитуменьшениемассымолекулыантибиотика за счёт потери атома углерода и атома кислорода 384 Da  358Da.65Рисунок 4.

Схема ферментативного гидролиза молекулы антибиотикаТаккаккарбапенемныеантибиотикиявляютсянестабильнымимолекулами и медленное образование гидролизованных форм в растворевозможно без влияния ферментов, в данной методике показателемкарбапенемазной активности является исчезновение пика, соответствующегоисходной форме меропенема (рисунок 5).Рисунок 5. Пример результатов анализа масс-спектра, где верхний массспектр – контрольный раствор меропенема (пик соответствует массемолекулы антибиотика), средний масс-спектр с отсутствующимпиком меропенема – после инкубирования клеток штаммапродуцента карбапенемазы в растворе меропенема. Нижний массспектр – инкубирование раствора меропенема вместе с взвесьюклеток штамма не продуцирующего карбапенемазу.66Апробация метода.Метод был апробирован на коллекции фенотипически типированныхнозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae.

Из 475 изолятов былиотобраны все изоляты, демонстрирующие снижение чувствительности хотябы к одному из карбапенемных антибиотиков (меропенем, имипенем,дорипенем, эртапенем). В качестве критерия отбора было использованопревышение значений МПК штамма эпидемиологической точки отсеченияпо критерию EUCAST (http://www.eucast.org).По данному критерию были отобраны 98 изолятов, из которых 22 былиположительны при анализе карбапенемазной активности с использованиемсобственного протокола.Наличие генов, кодирующих ферменты NDM-1, VIM-4 и OXA-48 былоподтверждено у 18 изолятов, а 4 изолята, после повторной идентификации,былиотнесеныкнеферментирующимбактериям:Stenotrophomonasmaltophilia (n=2), Acinetobacter baumanii и Achromobacter xylosoxia, длякоторыххарактернысобственныехромосомно-локализованныекарбапенемазы.В ходе отработки методики были определены следующие факторы,которые необходимо учитывать при внедрении масс-спектрометрическогометода детекции карбапенемаз:1.

Спонтанная деградация антибиотика в растворе2. Ферментативный гидролиз3. Чувствительность прибора4. Образование различных солей антибиотика5. Отсутствие количественной оценки6. Сорбция антибиотика мишенями673.1.2. Оптимизация методов молекулярной детекции геновкарбапенемазДлямолекулярнойдетекциигеновкарбапенемазспомощьюполимеразной цепной реакции с форезным методом детекции, быларазработана мультиплексная ПЦР на гены blaKPC-типа, blaOXA-48-типа, а такжеblaNDM-типа.Даннаяреакцияобеспечиваетвыявлениенаиболеераспространённых вариантов карбапенемаз в Санкт-Петербурге и Москве упредставителей семейства Enterobacteriacea. Подбор праймеров проводился сучётом консервативных участков генов карбапенемаз приведённых в таблице2.Таблица 2.Список генов карбапенемаз, использованных при подборе праймеров вмультиплексной ПЦР для выявления генов blaKPC-типа, blaNDM-типа и blaOXA48-типа.ФерментНомер референса Ферментв базе GenBankNDM-1НомерФерментреференса вбазе GenBankFN396876OXA-48Номерреференса вбазе GenBankAY236073KPC-1AF297554KPC-2AY034847NDM-2JF703135OXA-162HM015773KPC-3AF395881NDM-3JQ734687OXA-163HQ700343KPC-4AY700571NDM-4JQ348841OXA-181JN205800KPC-5EU400222NDM-5JN104597OXA-204JQ809466KPC-6EU555534NDM-6JN967644OXA-232JX423831KPC-7EU729727NDM-7JX262694OXA- 244JX438000KPC-8FJ234412NDM-8AB744718OXA-245JX438001KPC-9FJ624872NDM-9KC999080OXA-247JX893517KPC-10GQ140348NDM-10KF361506KPC-11HM066995NDM-12AB926431KPC-12HQ641421NDM-13LC012596KPC-13HQ342889NDM-14KM21008768KPC-14JX524191NDM-15KP735848KPC-15KC433553NDM-16KP862821KPC-16KC465199KPC-17KC465200KPC-18KP681699KPC-19KJ775801KPC-22KM379100Подобранныепраймеры,атакжедлинапродуктовамплификации,представлены в таблице 3.Таблица 3.Праймеры для мультиплексной амплификации генов blaKPC-типа,blaOXA-48-типа и blaNDM – типовМишеньНазваниеПоследователность праймера 5’-3’праймераblaKPCblaOXAblaNDMПродукт (пароснований)MKPCFGCTGACCAACCTCGTCGCGGAAMKPCRGCCTCGCTGTGCTTGTCATCCMOXAFTAATCTTAAACGGGCGAACCAMOXARAAGTTCAACCCAACCGACCCAMNDMFTGCTCAGTGTCGGCATCACCMNDMRGAACCAGCAACCGCGCCCA75351417669Температурный протокол амплификации представлен в таблице 4:Таблица 4.Температурный протокол амплификации генов blaKPC-типа, blaOXA-48типа и blaNDM – типов.Т0СВремяЦикл955 минутХ19515 секундХ256215 секунд7215 секунд722 минутыХ1В результате тестирования данной мультиплексной реакции натипированных изолятах с известной нуклеотидной последовательностьюгенов карбапенемаз (blaKPC-2, blaOXA-48 и blaNDM-1), были получены чёткиебэнды,соответствующиерасчётнымразмерам.Фотографиягеляпредставлена на рисунке 6.Рисунок 6.

Фотография гель-электрофореза амплификации мультиплекснойПЦР с праймерами, представленными в таблице 2. NDM –амплификация ДНК выделенной из штамма-продуцента гена blaNDM1, OXA - амплификация ДНК выделенной из штамма-продуцентагена blaOXA-48, KPC-амплификация ДНК выделенной из штаммапродуцента KPC-2, X – амплификация смеси равных объемов ДНК,использованных в пробах NDM, OXA и KPC. NEG – отрицательныйконтроль.70Для сравнения длин полученных ампликонов в мультиплекснойреакции с расчётными, был поставлен капиллярный электрофорез(Рисунок 7)Рисункок 7. Данные капиллярного электрофореза, где крайние пикисоответствуют внутреннему стандарту, пики с значением 23 и 35 –области масс праймеров и три пика, соответствующие значениям 179п.о, 523 п.о.

и 774 п.о. соответствующих бэндам, полученным в ходемультиплексной реакции.Соответственно, ожидаемые размеры ампликонов совпадают срасчётными в пределах погрешности прибора 5%.***Оптимизированные и внедрённые в практику методы позволяютэффективно и быстро выявлять карбапенемазную активность, а такжеосновные гены карбапенемаз. Комбинирование данных методов необходимов связи с большим числом описанных в мире генов карбапенемаз, что делаетприменение только методов на основе ПЦР не рациональным. Также, невсегда продукция карбапенемаз сопровождается повышением МПК ккарбапенемным антибиотикам до уровня более 8 мг/л, при этом важноопределить связано ли повышение МПК с альтернативными механизмамиустойчивости (эффлюкс и пр.), или наличием фермента.