Диссертация (Молекулярная характеристика продуцентов карбапенемаз семейства Enterobacteriaceae, выделенных в Санкт-Петербурге), страница 13

Например, ген armA являющийсяметилазой выявлен у нозокомиальных изолятов несущих различные геныкарбапенемаз и относящихся к различным клональным группам, что являетсяповодомпредположитьвысокуючастотуданногогенанаплазмидах,циркулирующих в среде нозокомиальных изолятов. Устойчивости к β-лактамнымантибиотикам обусловлена разнообразными β-лактамазами, включающими, кромекарбапенемаз, ферменты обладающие относительно узким спектром активности,как blaTEM-1, blaSHV-1, так и β-лактамазы расширенного спектра действия, какblaCTX-M-15. Устойчивость к хинолонам и фторхинолонам обусловлена двумявариантами реализации механизма защиты – активное выведение молекулыантибиотика из клетки (oqxA, oqxB и др.), а также модификация молекулыантибиотика(qnrB1,qnrS1).Вовсехпроанализированныхштаммахзаустойчивость к фосфомицину отвечает ген fosA, кодирующий ферментмодифицирующий молекулу антибиотика, также распространены механизмы79устойчивостикфосфомицинуопосредованныемодификациеймишениантибиотика.У пяти из семи изолятов, устойчивость к макролидам, обусловленадействием генов msr(E), mph(E), модифицирующими молекулу антибиотика, убольшинства изолятов представлены оба гена.

К хлорамфениколу активностьпроявляют ферменты кодируемые генами catB3 и catA1, только у одного из семиизолятов не найдено генов данной группы, которые ацетилируют молекулуантибиотика. В геноме исследуемых изолятов обнаружены гены sul1 и sul2, обагена кодируют дигидроптеоратсинтетазу (модификация молекулы антибиотика).За устойчивость к тетрациклину отвечают найденные в двух изолятах гены tetA,обеспечивающие активное выведение молекул антибиотика из клетки.

Ктриметопримуустойчивостьобеспечиваетсядигидрофтолатредуктазами,кодируемыми генами dfrA12, dfrA14 и dfrA1.Полученныеданныеосовокупностиприобретённыхдетерминантрезистентности нозокомиальными штаммами, продуцирующими карбапенемазы,подтверждаюттенденциюформированияпанрезистентногофенотипавнутрибольничным штаммами, за счёт горизонтального переноса генов всочетании с селективным давлением различных схем антимикробной терапии.3.3 Оценка частоты носительства и разнообразия продуцентовкарбапенемаз пациентами отделений хирургии в Санкт-ПетербургеДляоценкираспространенияштаммов-продуцентовкарбапенемазвстационарах Санкт-Петербурга, было проведено исследование на носительствоподобных изолятов среди пациентов отделений хирургии пяти лечебнопрофилактических учреждений Санкт-Петербурга.

В качестве изучаемогоматериала использовался ректальный мазок. Был разработан следующий планисследования, рассчитанный на 5 дней для каждого из ЛПУ.День 1.Этап 1. Забор ректального мазка с помощью урогенитального зонда.80Транспортировка кончика урогенитального зонда в фосфатном буфере (объём 1мл, pH=7.4)Этап 2. Вортексирование пробирки с ректальным мазком 5 минут, удаление изпробирки кончика урогенитального зонда. Забор 333 мкл.

объёма фосфатногобуфера с образцом для хранения при - 700 С. Центрифугирование 7 минут при 5тыс. об. мин. на микроцентрифуге, удаление супернатанта. Ресуспензированиеосадка в 100 мкл. бульона МХ с меропенемом (1 мг/л).50 мкл. – посев на среду McConkey с добавлением меропенема в концентрации 1мг/литр (среда готовиться непосредственно перед посевом).К оставшимся 50 мкл. вносилось 500 мкл. Бульона МХ с меропенемом вконцентрации 1 мг/литр, после чего пробирка помещается в термостат на 18часов.День 2Этап 3. Идентификация выросших за ночь колоний, посев чистых культур насреду McConkey без добавления меропенема.Этап 4.

Выделение ДНК из ночного инокулюма, постановка Real-time-PCR наосновные гены карбапенемаз (KPC/OXA-48/NDM/IMP/VIM)День 3Этап 5. Выделение ДНК и RT-PCR чистых культур на гены карбапенемаз.День 4Этап 6. Внесение культур в музей, определение фенотипа с помощью методасерийных микроразведений к следующим антибиотикам: Меропенем, Имипенем,ПолимиксинДень 5Этап 7. Учет фенотипов.81Результаты:Всего было получено 140 образцов, в таблице 9 приведены все образцы собнаруженными генами карбапенемаз. Все пробы были получены в период сапреля по декабрь 2014 года.

Для детекции генов blaOXA-48-типа, blaKPC-типа,blaNDM, IMP, VIM – типов, а также карбапенемаз, характерных для рода Acinetobacter,использовались готовые наборы фирмы ООО «Интерлабсервис» для проведенияПЦР-анализа с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (Real Time PCR)«АмплиСенс MDR KPC/OXA-48-FL», «АмплиСенс MDR MBL-FL», «АмплиСенсMDR Ab-OXA-FL».Таблица 9.Характеристика положительных образцов на гены карбапенемаз, полученных входе исследования на носительство в отделениях хирургии лечебнопрофилактических учреждений Санкт-Петербурга№Стационар Микроорганизм ПЦР М/о*(NDM,KPC,IMP,OXA48,VIM)1АA.

baumaniiПЦРПЦР A. IMI** MEM PNпервичный baumaniiматериал(NDM,KPC,IMP, OXA,VIM)OXA-40OXA-406АA. baumaniiOXA-40OXA-4064>640,037АA. baumaniiOXA-40OXA-4064>640.068АA. baumaniiOXA-40OXA-4064>640.0610АA. baumaniiOXA-40OXA-4064>640.0311АA. baumaniiOXA-40OXA-4014АA. baumaniiOXA-40OXA-4032>640.1215АA. baumaniiOXA-40OXA-4064>640,0316АA. baumaniiOXA-40OXA-4064>640.0619АK. pneumoniae16320.1220АA. baumanii64>640.12OXA-48OXA-48OXA-40OXA40;OXA-238223BK. pneumoniaeNDMNDM>64>640.1224BK.

pneumoniaeNDMNDM, OXA>64>64>1624BA. baumanii>64>640.0325BK. pneumoniaeNDMNDM, VIM>64>640.0326BK. pneumoniaeNDMNDM>64>640.0326BA. baumanii>64>64>1627BK. pneumoniae>64>640.0327BA. baumanii64>640.0628BK. pneumoniae>64>640.1228BA. baumanii>64>64129BK. pneumoniae16160.0630BA. baumanii>64>64>1631BK. pneumoniaeNDMNDM>64>640.2532BK.

pneumoniaeNDMNDM>64>64133BK. pneumoniaeNDMNDM>64>64>1634BK. pneumoniaeNDMNDM>64640.01534BA. baumaniiOXA-40OXA-40640.0635BA. baumaniiOXA-40OXA-4064>64>1636BK. pneumoniae>64>640.0338BA. baumaniiOXA-40OXA-4064>640.0340BA. baumaniiOXA-40OXA-4032>640.0345BK. pneumoniaeNDMNDM>64>640.0346BK. pneumoniaeNDMNDM64>640.0647BK. pneumoniaeNDMNDM16640.2549B1K. pneumoniaeNDMNDM32640.1250B1A. baumaniiOXA-40OXA-4032>640.0359BН.р.***OXA-4062BA.

baumaniiOXA-40OXA-4032>640,0363BA. baumaniiOXA-4032>640.0664BK. pneumoniae64BA. baumaniiOXA-40OXA-4092DA. baumaniiOXA-40OXA-40<0,25<0,5<0,12107 DA.baumaniiОХА-40ОХА-40>32>32<0.12OXA-40OXA-40NDMOXA-48OXA-40NDMOXA-40NDMOXA-40NDMOXA-40NDMOXA-40NDM, VIMOXA-40NDMOXA-40OXA-40NDMOXA-4883110 EK.pneumoniae116 EKPCKPC16320.5K.pneumoniaeKPC>32>320.5118 EН.р.KPC122 EK.pneumoniaeKPC16320.5124 EP.aeruginosaVIM>32>320.5124 EK.pneumoniaeKPC>32>320.5*ПЦР М/о – полимеразная реакция чистой культуры полученной путёмвысева образца на селективную среду, содержащую карбапенемныйантибиотик.** IMI – Имипенем, МЕМ – меропенем, PN – полимиксин В.*** Н.р.

– нет ростаГены карбапенемаз были обнаружены в 43 образцах, что составило 30,7% отобщего числа полученных образцов. В двух образцах были одновременновыделеныдвакарбапенемазо-продуцирующихмикроорганизма–номераобразцов 64 и 124. В образце №64 были выделены K. pneumoniae (OXA-48-тип) иA. baumanii (OXA-40-тип).

В образце №124 были выделены P. aeruginosa (VIMтип) и K. pneumoniae (KPC-тип). В двух образцах, гены карбапенемаз (KPC-типа)были обнаружены только в исходной суспензии, при посеве микроорганизмы,продуцирующие данные ферменты не были обнаружены. Все микроорганизмыкроме №92 демонстрировали устойчивость к карбапенемным антибиотикам(меропенему и имипенему).

Несколько изолятов демонстрируют устойчивость кполимиксину В: 2 изолята K. pneumonia, продуцирующих ген blaNDM-1, а также дваизолятаA.baumanniiпродуцирующихOXA-40.Изпятистационаров,предоставлявших материал, только в одном не были обнаружены продуцентыкарбапенемаз.843.4 Детальный молекулярный и фенотипический анализ первогоизолята-продуцента карбапенемазы KPC-2 выделенного в РоссииВ 2012 году, в Санкт-Петербурге, от пациентки с онкологическимзаболеванием и воспалением почек, с поездкой во Вьетнам в анамнезе, былвыделенизолятKlebsiellapneumoniae.Данныйизолятдемонстрировалустойчивость фактически ко всем антибиотикам. С помощью сервиса ResFinder2.1 на основе данных полногеномного (shot gun) секвенирования выделенногоизолята, был проведён анализ его резистома. Фенотип и данные анализаполногеномного секвенирования представленный в таблице 10.Таблица 10.

Фенотип и резистом изолята KP 565.АнтибиотикАмпициллинЦефотаксимЦефоперазон-сульбактамЦефтазидимЦефтазидим/клавуланатЦефепимЦефепим/клавуланатАзтреонамЭртапенемИмипенемМеропенемДорипенемБиапенемГентамицинАмикацинМИКмг/л)512>256>128>128>128>128>128>64>64>6464>16641281ФосфомицинЦипрофлоксацин128>256Ко-тримоксазол>32ХлорамфениколМакролид-ЛинкозамидСтрептограминВТетрациклин256nd*strA (100%)aac(3)-IIa (99,7%)aac(6')Ib-cr (100%)strB (100%)fosA (413/420 98,79%)oqxA (99,49%)QnrS1 (100%)oqxB (1715/2450 99,07%)aac(6')Ib-cr (100%)dfrA14 (99,59%)sul2 (100%)catB3 (442/633 100%)mph(A) (100%)ndtet(A) (100%)* nd – нет данныхДетерминанты устойчивостиblaTEM-1 (570/861 99,82%)blaSHV-11 (99,88%)blaCTX-M-15(100%)blaKPC-2 (100%)85Сопоставление выявленных генов приобретённой устойчивости и фенотипаданногоизолята,демонстрируетспособностьнозокомиальныхизолятовнакапливать детерминанты резистентности к различным классам антибиотиков,причёмданнаятенденция,наблюдаетсянезависимоотклональнойпринадлежности изучаемого изолята, что подтверждает актуальность проблемыраннего выявления продуцентов карбапенемаз, как бактерий, преодолевающихпоследнюю линию антимикробной обороны.Анализ сиквенс-типа выявил ST273, для которого ранее наличие гена blaKPC-2не было описано в литературе.

Данный сиквенс-тип относится к клональномукомплексу 147 (СС147), не связанному с глобально распространенной клональнойгруппой CG258, на которую приходится более 80% случаев выявления геновblaKPC-типа. Клональная структура популяции Klebsiella pneumoniae представленана Рис. 7. Схема клонального комплекса CC 147 представлена на рисунке 8. Политературным данным, представители данного комплекса не связаны совспышками выявления генов blaKPC-типа.86Рис. 7.

Клональная структура популяции Klebsiella pneumoniae построенная наоснове базы MLST (http://www.pasteur.fr/mlst). Данная схема построена спомощью алгоритма eBurst. Иллюстрация взята из статьи (Baraniak et al.2013) с дополнениями.Рис.8 Структура клонального комплекса 147 (CC147). Схема построена спомощью алгоритма eBurst на основе базы данный института Пастера(Франция) http://www.pasteur.fr/mlst.873.4.1. Исследование мобильного элемента, несущего ген blaKPC-2.Для выявления локализации гена blaKPC-2, были поставлены эксперименты поэлектропорации плазмидной ДНК из изолята KP565 в штамм E.