Диссертация (Молекулярная характеристика продуцентов карбапенемаз семейства Enterobacteriaceae, выделенных в Санкт-Петербурге)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНОИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ДЕТСКИХ ИНФЕКЦИЙ ФЕДЕРАЛЬНОГОМЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА»На правах рукописиАГЕЕВЕЦ ВЛАДИМИР АНДРЕЕВИЧМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУЦЕНТОВКАРБАПЕНЕМАЗ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE,ВЫДЕЛЕННЫХ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ03.02.03 – микробиологияДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:д. м.

н., профессор Сидоренко С. В.Санкт-Петербург20162ОглавлениеСтр.Введение5ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ181.1. Появление антимикробной резистентности191.2. Механизм действия β-лактамных антибиотиков211.3. Устойчивость к β-лактамным антибиотикам, не связанная с22продукцией β-лактамаз1.4. Классификация β-лактамаз241.5. Происхождение β-лактамаз301.6. Механизмы гидролиза β-лактамазами311.7. Основные общественно-значимые карбапенемазы331.7.1. Карбапенемазы IMP-группы341.7.2. Карбапенемазы VIM-группы351.7.3. Карбапенемазы KPC-группы371.7.4. Карбапенемазы OXA-48-группы401.7.5. Карбапенемазы NDM-группы411.8.

Выявление инфекций, вызванных продуцентами карбапенемаз и46бессимптомного носительства1.9. Глобальная эпидемиология карбапенемаз49ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ552.1. Фенотипические методы исследования5532.1.1. Выделение, хранение и идентификация изолятов552.1.2. Определение чувствительности к антибактериальным изолятам552.2. Генотипические методы исследования562.2.1. Постановка ПЦР (выделение ДНК, амплификация, электрофорез)562.2.2. Мультилокусное сиквенс-типирование582.3. Полногеномное секвенирование582.4. Выделение плазмидной ДНК, трансформация, конъюгация592.5.

Обработка результатов исследования61ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ633.1. Оптимизация метода детекции карбапенемазной активности63грамотрицательных бактерий с помощью MALDI-TOF массспектрометрии и методов детекции генов карбапенемаз3.1.1. Оптимизация метода детекции карбапенемазной активности63изолятов с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии3.1.2. Оптимизация методов молекулярной детекции генов67карбапенемаз3.2. Анализ молекулярной эпидемиологии штаммов-продуцентов71карбапенемаз циркулирующих на территории Санкт-Петербурга3.2.1. Анализ молекулярной эпидемиологии штаммов-продуцентов гена71blaNDM-13.2.2. Анализ молекулярной эпидемиологии штаммов-продуцентов гена73blaKPC3.2.3.

Анализ молекулярной эпидемиологии штаммов-продуцентов генаblaOXA-487443.2.4. Анализ молекулярной эпидемиологии штаммов-продуцентов гена75blaVIM-43.2.5. Анализ резистома типовых продуцентов карбапенемаз на основе75данных полногеномного секвенирования3.3. Оценка частоты носительства и разнообразия продуцентов79карбапенемаз пациентами отделений хирургии Санкт-Петербурга3.4.

Детальный молекулярный анализ первого изолята-продуцента84карбапенемазы blaKPC-2, выделенного в России3.4.1. Исследование мобильного элемента несущего ген blaKPC-2873.4.2. Эпидемиология и возможная эволюция мобильных элементов93включающих ТЕМ-КРС - комплексГЛАВА 4.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ964.1. Сравнение внедрённых в практику методов детекции карбапенемаз96с аналогами4.2. Особенности эпидемиологии карбапенемаз в Санкт-Петербурге984.3. Носительство карбапенемаз и его роль в их распространении1014.4. Новый вариант генетического окружения гена blaKPC-2102Заключение104Выводы106Практические рекомендации107Список сокращений108Благодарности110Список использованной литературы1115ВведениеАктуальность исследованияВ течение более тридцати лет карбапенемные антибиотики былиключевым звеном в терапии нозокомиальных инфекций, вызванныхпатогенами, устойчивыми к другим группам антибиотиков.

Первыйкарбапенемный антибиотик – имипенем был внедрен в практику в начале1980-х годов (Baumgartner et al., 1983), практически, одновременно с первымописанием бета-лактамаз расширенного спектра действия (БЛРС, ESBL –Extended-spectrum-beta-lactamase),которыеэффективногидролизуютпенициллины и цефалоспорины I – IV поколений, но не карбапенемныеантибиотики. За карбапенемами закрепился штамп «последняя линияантимикробнойобороны»,которыйприменяетсячтобыподчеркнутьзначимость антибиотиков данной группы в лечении тяжёлых инфекций.Быстрое распространение БЛРС привело к резкому снижению ролибольшинства бета-лактамов в лечении тяжелых госпитальных инфекций,возрастанию роли и частоты применения карбапенемов.

Следствием сталоформирование и распространение резистентности к этим антибиотикам.Причинойпоявленияубактерийрезистентностиккарбапенемнымантибиотикам могут быть: модификация мишени действия препаратов врезультате спонтанных мутаций в кодирующих их генах, активное выведениеантибиотика из клетки (эффлюкс), нарушение проницаемости внешнихструктур микробной клетки, инактивация молекулы антибиотика, а такжеразличные комбинации данных механизмов. Несмотря на существованиеразличных механизмов формирования приобретённой устойчивости ккарбапенемным антибиотикам, наибольшей угрозой во всём мире признанораспространение резистентности за счёт инактивации молекулы антибиотикаподдействиемрасщепляющихферментовмолекулыгруппыкарбапенемаз,карбапенемногот.е.ферментов,антибиотика.Инфекции,вызванные CPE (carbapenemase producing Enterobacteriaceae), связаны с6высоким уровнем смертности (Gasink, Edelstein et al.

2009), по разнымоценкам, достигающим 50-90% (Schwaber et al. 2008, Ben-David et al. 2012).По оценке экспертов центров по контролю за заболеваниями США (CDC –Centres for Diseases Control), распространение энтеробактерий, устойчивых ккарбапенемам, рассматривается как одна из трех наиболее серьезных угрозсистеме здравоохранения (Enfield et al. 2014).Особенностью наиболее значимых генов, кодирующих карбапенемазы,является их локализация на мобильных генетических элементах, чтообеспечивает им быстрое внутри- и межвидовое распространение, в ходегоризонтального переноса.

Наиболее характерным примером быстрогораспространениягеновкарбапенемазможетслужитьпоявлениеираспространение фермента NDM-1, который впервые был описан в 2009 году(Yong et al. 2009), а ретроспективно его удалось обнаружить в коллекции2006 года. На сегодняшний день, случаи выявления этого гена у клиническихизолятов были описаны более чем в 40 странах.Опасность быстрого распространения продуцентов карбапенемазусугубляется рядом важных фактов, так для этих бактерий характерноналичие ассоциированной резистентности к антибиотикам большинствагрупп, в ряде случаев возможно формирование «панрезистентных» штаммов,при этом в ближайшие 4 – 5 лет появление в медицинской практике новыхантибиотиков,преодолевающихэтотмеханизмрезистентности,маловероятно. Сложившаяся ситуация связана с риском возврата в«доантибиотическуюэру»,когдадаженетяжелыепосовременнымпредставлениям инфекции будут приводить к летальным исходам.

Такимобразом, очевидно, что сдерживание распространения карбапенемаз следуетотнести к наиболее актуальным задачам современного здравоохранения. Всвою очередь, очевидно и то, что эффективно решить указанную задачу бездетальногопониманиязакономерностейрезистентности невозможно.процессовраспространения7Степень разработанности темы исследованияПервыйслучайпродукциипредставителемEnterobacteriaceaeфермента способного разрушать молекулы карбапенемных антибиотиков(NmcA) был описан в 1993 году (Naas and Nordmann 1994). С начала 1990хх,описано большое количество различных карбапенемаз, относящихся, восновном, к трём молекулярным классам A, B и D (Queenan and Bush 2007).В 2013 году наиболее распространёнными карбапенемазами в Европебыли KPC-тип (Klebsiella pneumonia carbapenemase), VIM-тип (Veronaintegron-encoded metallo-beta-lactamase), IMP-тип (IMP-type metallo-betalactamase), NDM-тип (New Delhi metallo-beta-lactamases) и OXA-48-тип(OXA-48-like carbapenem-hydrolysing oxacillinases) (Walsh et al.

2010,Nordmann et al. 2011). Распространение различных карбапенемаз на 2013 годв Европе по данным Европейского центра профилактики болезней иконтроля (European Centre for Disease Prevention and Control) имеетследующую картину: эндемичными очагами названы Италия и Греция (пятаягруппа по эпидемиологической шкале), внутрибольничное распространениеCPE происходят в Израиле, Ирландии, Венгрии (4 группа). Всего в 26странах Европы ситуация находится в состоянии от регулярных вспышек доэндемической, в девяти странах обнаружены единичные случаи и в трёхстранах нет выявленных случаев инфекций, вызванных CPE: в Исландии,Черногории и Македонии.В России по состоянию на 2012 год было достаточно хорошо изученораспространение карбапенемаз у P.