Диссертация (1145980), страница 10
Текст из файла (страница 10)
2010, Nordmann et al. 2011). Такжегены blaNDM выявлены у наибольшего разнообразия видов бактерий (Walsh etal. 2011). Вторым резервуаром продуцентов NDM является Балканскийполуостров,приэтомэпидемиологическаясвязьсиндийскимсубконтинентом остаётся неизвестной (Livermore et al. 2011, Halaby et al.2012). Быстрое распространение продуцентов NDM по всему миру на первомэтапе было связано с медицинским туризмом жителей Европы в эндемичныеобласти для этого фермента.
Спустя некоторое время, эпидемиологическаясвязь с индийским полуостровом потерялась и передача продуцентов началапроисходить между странами далёкими от Индии или Балканскогополуострова (Kim et al. 2012).Продуценты OXA-карбапенемаз впервые были обнаружены в Турции в2001 году, где отмечали их редкие внутрибольничные вспышки (Poirel et al.2004). После Турции вспышки продуцентов OXA-48-типа были выявлены встранах западной Азии и северной Африки (Carrer et al.
2010, Cuzon et al.2010), после чего добрались до стран западной Европы. Тем не менее,основным резервуаром карбапенемаз типа OXA-48 остаются страны, где онивпервые были описаны. Хотя, по данным ФГБУ НИИДИ ФМБА России вМоскве ситуация с распространением OXA-48 очень тяжёлая, покапубликаций по этой теме нет (на середину 2015 года).Стоит подвести итог, что серьёзная работа по выявлению продуцентовкарбапенемаз ведётся в первую очередь в странах Европы и США.
До 201254годавРоссииEnterobacteriaceaсерьёзныхнаналичиеисследованийгеновпредставителейкарбапенемазнесемействапроводилось,аналогичная ситуация во множестве стран, так что полная картинараспространенияиразнообразиягенов,кодирующихразличныекарбапенемазы, остаётся туманной. Исследования в области эпидемиологиигенов кодирующих карбапенемазы на территории России и СанктПетербурга в частности, необходимы для оценки динамики распространенияустойчивостиккарбапенемнымантибиотикам,атакжеэффективности принимаемым мер по сдерживанию данного процесса.оценки55ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1.
Фенотипические методы исследования2.1.1. Выделение, идентификация и хранение изолятовВ работу включены 1115 изолятов семейства Enterobacteriaceae,выделенных от больных с разными формами внутрибольничных инфекций.Изоляты были собраны в период 2011-2015 годах в стационарах СанктПетербурга и Москвы. Источниками выделения микроорганизмов были:раневоеотделяемоеразличногопроисхождения(ожоговыераны,остеомиелиты, хирургические раны), мокрота (пневмонии), кровь (сепсис),носоглоточные мазки, отделяемое при инфекциях мягких тканей, ликвор,кал.Выделенныевлечебныхучрежденияхизолятыхранилисьитранспортировались в НИИДИ на среде, содержащей 1% - колумбийскогоагара («BioMérieux», Франция), 10% сахарозы, 30% глицерина и разлитой впробирки типа эппендорф.
Идентификацию ночных культур, выращенных наагаре Мюллера-Хинтона, проводили с помощью MALDI-TOF массспектрометра Microflex LT («Bruker Daltonics», Германия), со среднимкоэффициентом идентификации (score) 2,2±0,7. В лаборатории ФГБУНИИДИ ФМБА России изоляты депонировались в музей культур сиспользованием вышеописанной среды и хранились при -75°С. Дляпроведения последующих исследований культуры восстанавливали на средеМюллера-Хинтона.2.1.2. Определение чувствительности к антибактериальнымпрепаратамАнтибиотикочувствительностьоценивалиметодомсерийныхмикроразведений с определением минимальной подавляющей концентрации(МПК) в бульоне Cation-Adjusted Mueller Hinton (CAMH) II Broth («BectonDickinson», США), в соответствие с рекомендациями CLSI 2011- 2013. Дляпостановки опыта использовали ночные культуры, выращенные на агаре56Мюллера-Хинтона.микроразведений,Непосредственноготовилипередбактериальнуюпостановкойсуспензиюпосерийныхстандартумутности 0,5 McF в стерильном физиологическом растворе.
Далееполученную взвесь клеток разводили в 100 раз бульоном CAMH, ииспользовали для инокуляции с тестируемыми антибиотиками.Былииспользованы следующие субстанции антибиотиков: ампициллин (AMP),цефотаксим (CTX), цефоперазон-сульбактам (CSL), цефтазидим (CAZ),цефтазидим-клавуланат (CAZ/CC), цефепим (FEP), цефепим-клавуланат(FEP/CC), азтреонам (ATM), эртопенем (ERT), имипенем (IMI), меропенем(MER), дорипенем (DOR), биапенем (BIA), гентамицин (GEN), амикацин(AMK), тигециклин (TYG), полимиксин В (POL), фосфомицин (FOS),ципрофлоксацин(CIP),хлорамфеникол (CHL).триметоприм-сульфометаксозол(SXT),Постановку опыта проводил в 96 луночныхпланшетах для иммуноферментного анализа (НПО «Медполимер», СанктПетербург). В каждом планшете делали 11 разведений (ряды 1-11) с 2 - хкратным шагом, 12 лунка использовалась как контроль роста.
Один планшетсодержал 8 антибиотиков (ряды A-H). За МПК принимали лунку в рядеразведений, где отсутствовал видимый рост культуры при положительномросте в контрольной лунке. Базовые растворы антибиотиков хранили неболее 6 месяцев при -75°С, рабочие растворы использовали ex tempore.2.2 Генотипические методы исследования2.2.1. Постановка ПЦР (выделение ДНК, амплификация,электрофорез)Дляпроведенияхозяйствадляопределениякарбапенемазтипированияпроцедурыгенов(амплификациямультилокусногорезистентности),использовалиПЦРсатакжегеновдомашнегосиквенс-типирования,длядетекцииэлектрофоретическойгеновдетекциейпродуктов амплификации.
Выделение тотальной бактериальной ДНКпроводили с помощью наборов «ДНК-сорб Б» («АмплиСенс», Россия),57согласно протоколу производителя. Подбор праймеров, а также расчетмультиплексныхсетов,множественныевыравниванияиоценкуспецифичности осуществляли соответственно в Oligo v.7.0, ClustalW, и NCBIПраймеры синтезированы вBLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).ЗАО «Евроген» (Россия). Для ПЦР использовали готовые мастермиксы «HS(ЗАОScreenMix»«Евроген»)реакцию/мультиплекс,объемвконечномвносимойДНКобъеме25составлялмкл10намкл.Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-Технология»,Россия). Продукты амплификации разделяли в 2% агарозном геле(«Amresco», США) с бромистым этидием в 1Х ТАЕ буфере (НПФ «Литех»,Россия) при напряжении 100 V в течение 25 минут.
В качестве маркераиспользовали ДНК лестницу (100 – 3000 п.н., 12 бэндов) 100 bp DNA Ladder(«Axyprep»,США).Электрофореграммыполучалис использованиемсистемы гель – документации GelDoс («Bio-Rad», США).Длядетекциигеновкарбапенемазиспользовалисьпраймеры,представленные в таблице 1 (Poirel et al. 2011).Таблица 1.Праймеры, использованные для детекции генов карбапенемазНазваниеПоследовательностьРазмер ампликона(п.о.)IMP-FGGAATAGAGTGGCTTAAYTCTCIMP-RGGTTTAAYAAAACAACCACCSPM-FAAAATCTGGGTACGCAAACGSPM-RACATTATCCGCTGGAACAGGAIM-FCTGAAGGTGTACGGAAACACAIM-RGTTCGGCCACCTCGAATTGVIM-FGATGGTGTTTGGTCGCATAVIM-RCGAATGCGCAGCACCAGOXA-FGCGTGGTTAAGGATGAACACOXA-RCATCAAGTTCAACCCAACCGblaIMP 232blaSPM 271blaAIM 322blaVIM 390blaOXA-48 43858GIM-FTCGACACACCTTGGTCTGAAGIM-RAACTTCCAACTTTGCCATGCBIC-FTATGCAGCTCCTTTAAGGGCBIC-RTCATTGGCGGTGCCGTACACSIM-FTACAAGGGATTCGGCATCGSIM-RTAATGGCCTGTTCCCATGTGNDM-FGGTTTGGCGATCTGGTTTTCNDM-RCGGAATGGCTCATCACGATCDIM-FGCTTGTCTTCGCTTGCTAACGDIM-RCGTTCGGCTGGATTGATTTGKPC-FmCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGKPC-RmCTTGTCATCCTTGTTAGGCGblaGIM 477blaBIC 537blaSIM 570blaNDM 621blaDIM 699blaKPC 7982.2.2 Мультилокусное сиквенс-типированиеМультилокусноесиквенс-типирование(MLST)осуществлялипообщепринятой схеме в соответствии с (Diancourt, Passet et al.
2005). Реакциясеквенирования была выполнена с использованием набора ABI Prism BigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready reaction Kit и системы ДНК-анализа ABI3730GeneticAnalyzer(«AppliedBiosystems»,США).Анализсеквенированных фрагментов генов домашнего хозяйства (rpoB, gapA, mdh,pgi, phoE, infB, tonB), а также определение аллельных профилей и сиквенс–типов осуществляли на сервере http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella//.2.3 Полногеномное секвенировниеПолногеномное секвенировние изолятов 57, 410, 552, 783, (blaNDM-1);565, 570 (blaKPC-2) a также 485 (blaOXA-48) было проведено c помощьюгенетическогоанализатораMiSeq(Illumina).Принципсеквенирования основан на технологии Solexa, включающей обогащениеметодом bridge-ПЦР на проточном чипе, секвенирование методом синтеза(SBS) с использованием флуоресцентно-меченных нуклеотидов и детекцию59светафлуоресценцииоткластеровДНК.Подготовкабиблиотекипроводилась с помощью кита Nextera XT DNA Library Preparation Kitсогласно рекомендациям производителя.
Среднее покрытие полученныхпоследовательностей составило х21.Полногеномное секвенирование плазмидной ДНК трансконъюгантабыло выполнено с помощью прибора Ion Torrent PGM. Подготовкабиблиотек была проведена с помощью следующих китов: Ion Xpress™ PlusFragment Library Kit, Ion PGM Template OT2 400 Kit, Ion PGM Sequencing 400Kit, Ion 318 v2 Chip Kit согласно инструкциям производителя. Среднеепокрытие полученных контигов составило х117.2.4 Выделение плазмидной ДНК, трансформация, конъюгацияВыделение плазмидной ДНКПлазмидная ДНК выделялась по протоколу адаптированному для работы сплазмидами длиной более 100 тыс.
п.о.:1. Выращивалась ночная культура на качалке при 370С2. Клетки осаждались из объёма 1,5 – 2 мл при 5 тыс. об. 5 минут3. Супернатант удалялся4. Осадок ресуспензировался в 100 мкл. буфера (50 mM глюкоза/10 mMEDTA/10 mM Tris-HCl pH=8.0)5. Вносилось 200 мкл. лизирующего раствора (готовитлся каждый разсвежий (0,2 М NaOH/ 1% SDS)). Аккуратно перемешивлся прикомнатной температуре6. Вносилось 150 мкл. 7,5 M ацетата аммония и 150 мкл.
хлороформа.Аккуратно перемешивалось.607. 10 минут инкубировалось на льду, после чего центрифугировалось 10минут при 15000 g (желательно при 4 0С).8. Супернатант переносился в 200 мкл. 30% ПЭГ/1,5 M NaCl. Аккуратноперемешивалось (mix by inversion). Остужалось на льду 15 минут.9. Осаждалась ДНК. Удалялся супернатант. Высушивалось иразводилось в H2O или TE-буфере.Приготовление электрокомпетентных клеток1. Штамм E.coli DH5a сеялся в 10мл. среды LB на ночь (overnight)2. 1.25 мл ночной культуры сеялся в колбу с LB, выращивался накачалке при 370С до ОП= 0,6 при длине волны 610 нм3.
Охлаждался на льду 20 минут, также охлаждались центрифужныестаканы4. Суспензия клеток переносилась в центрифужный стакан иосаждалась при 4000 g (4 0С 15 минут)5. Удалялся супернатант6. Ресуспензировалась в 125 мл. 10% глицерина7. Центрифугировался 15 минут при 4000 g и 40 С, удался супернатант8. Снова ресуспензировали в 5 мл. глицерина, повторяли отмывку9. Ресуспензировали в 500 мкл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
