Диссертация (1145980), страница 14
Текст из файла (страница 14)
coli DH5a итрансконъюгации с изолятом KP 565 в качестве донора и E. coli C-600 (AzR RifR) вкачестве реципиента. В экспериментах по электропорации не удалось получитьклетки E. coli, способные расти на среде с меропенемом, что, вероятно, связано сбольшим размером плазмиды. Задача по переносу плазмиды из исходного штаммав E. coli была выполнена с помощью трансконъюгации. Был отобрантрансконъюгант на селективной среде содержащей 0,5 мг/л меропенема и 300мг/л азида натрия.
У трансконъюганта была выявлена одна плазмида, котораябыла отсеквенирована по методике «секвенирования следующего поколения»(Next Generation Sequence). В результате полногеномного секвенированияплазмидной ДНК, было получено 61612 ридов со средней длиной 273 по. Сборкаde novo была выполнена с помощью программы Newbler De Novo Assembler v3.0.Были получены 9 контигов со средним покрытием х117.
Контиги былиобъединены с помощью секвенирования по Сенгеру.Был выявлен неканонический вариант генетического окружения гена blaKPC-2,генетическая карта которого представленный на рисунке 9.88Рис. 9. Карта гипотетического мобильного элемента, несущего ген blaKPC-2.Темным выделены области гомологичные варианту генетическогоокружения, описанные на плазмиде pKP048 (NCBI Reference Sequence:NC_014312.1).Гипотетическиймобильныйэлементфланкированинвертированнымиповторами Tn3-типа, включает в себя (слева направо) фрагмент гена транспозазы,в которой встроился мобильный элемент несущий гены устойчивости кмакролидам (mphA, mrx, mphR), IS- элемент Kpn8, фрагмент гена blaTEM, несущийоднонуклеотидные замены, не характерные для описанных ранее полныхвариантов данного гена.
Далее следует фрагмент, включающий ген blaKPC-2 итранспозазы, представляющие область гомолгичную каноническому вариантугенетического окружения, т.е. транспозону Tn4401 и его изоформам. Далееследует фрагмент несущий гены кодирующие ферменты антирестрикции (KlcA),фрагмент транспозона Tn1721, после чего следует фрагмент транспозона Tn3 сгеном blaTEM-1. Данный вариант генетического окружения имеет высокую степеньгомологии отдельных участков с вариантом NTEkpc-1a (Chen et al.
2014),представленным на плазмидеpKP048. Сравнение с данным вариантомгенетического окружения показало инсерцию мобильного элемента с генами89устойчивости к макролидам (см. выше), инсерцию фрагмента гена blaTEM, а такжезамену фрагмента транспозона Tn1721 на фрагмент транспозона Tn3.Ранее варианты генетического окружения включающие TEM-KPC комплексописывались только с помощью секвенирования по Сэнгеру, без полнойхарактеристики мобильного элемента, несущего данный комплекс. Описанныеранее варианты представлены в таблице 11.Таблица 11.Описанные варианты генетического окружения включающие TEM-KPCкомплекс.Вид МОДатавыделенияСтранавыделенияST/Inc-группаНомер записи в базеГенБанкAeromonashydrophilaKlebsiellapneumoniaeEscherichia coli2012КитайNDKC355363.12012СингапурST841/non IncFII2008АргентинаCitrobacter freundiiKlebsiella oxytocaKlebsiellapneumoniae N=5Klebsiellapneumoniae (TEM1)200820092006-2007АргентинаКитайКитай16 изолятов сразличнымиплазмидамиNDND2008ИзраильST15/IncNKC344543.1 (Koh,Cao et al.
2013)JN048641 (Gomez,Pasteran et al. 2011)JN048639.1NG_041239.1ND (Shen, Wei et al.2009)KJ510411.1(Chmelnitsky, Shklyaret al. 2013)Escherichia coli(KPC-3)Klebsiellapneumoniae 565До 2010КитайND2012РоссияST273/IncFIING_036720.1 (Li,Wei et al. 2011)KP008371.1В отличие от канонических вариантов локализации гена blaKPC-2 натранспозоне Tn4401, обладающим высокой специфичностью для K. pneumonia,относящихся к клональной группе 258 (ST258), выявленные ранее вариантыгенетического окружения включающие TEM-KPC комплекс не обладают видовойспецифичностью, из чего можно сделать предположение что мобильный элементили элементы несущие данный вариант окружения, обладают высокоймобильностью.90Установлено, что у изолята K.
pneumoniae 565 (ST273), ген blaKPC-2локализован на плазмиде, включающей два участка регуляции плазмид двухгрупп несовместимости: IncFII и IncR и в составе нового гипотетическимобильного генетического элемента – составного транспозона, фланкированногоTn3 – повторами.Анализ полногеномного сиквенса плазмиды, несущей ген blaKPC2показал её гомологию с семью плазмидами представленными в базе данныхГенБанк (GenBank). Филогенетическое древо представлено на Рис.9.АнализпоследовательностигенаrepA,являющегосясистематическизначимым при классификации, показал связь данной плазмиды с плазмидамиpc15-k; pK1HV; pKF3-94, которые выделены на территории Китая и Вьетнама(Рисунок 10). С учётом того, что пациент, у которого был выделен изолят KP 565,имеет в анамнезе поездку во Вьетнам, возможна эпидемиологическая связь с этимрегионом.91BLAST pairwise alignment tree, tree method; Fast Minimum Evolution; Max Seq.
Difference0,75Размер плазмиды; приобретённые гены резистентности; регионвыделения, номер записи в базе ГенБанк113685 по, Франция, GenBank: FO203500.1blaOXA-48; 167203 по; Франция; GenBank: NC_021502.1338850 по; США, GenBank: CP007734.1blaTEM-1, CTX-M-15; 95626 по; Китай; GenBank: HQ202266.1aadA2, aph(3’)-la, aph(4)-la, QnrS1, sul2, tet(A), dfrA12; 133191по; Вьетнам; GenBank: NC_020087.1blaTEM-1b, blaCTX-M-15; 94219 по; Китай; GenBank: FJ876826.1blaTEM-1b; blaKPC-2, QnrS1, mph(A);127970 по; Россия; GenBank:KP008371.1blaTEM-1a, blaOXA-9, blaCTX-M-15, blaNDM-1, aadA1; aac(6’)-lb, QnrS1;118061 по; США; GenBank: CP009115.1Рисунок 10.
Филогенетическое древо плазмид построенное с помощью алгоритма BLAST при сравнении полногеномнойпоследовательность плазмиды pKPAPSS с ближайшими по степени гомологии представленными в базеGeneBank. Приведены общие характеристики плазмид, отображенных на филогенетической схеме.
Подчеркнутынаименования плазмид, обладающие 100% гомологией по гену repA.92Рисунок 11. Выравнивание последовательности генетического окружения гена blaKPC-2, выявленного на плазмидеpKPAPSS (данное исследование), с вариантами описанными в Израиле (KJ510411.1) и Китае (NG_036720.1).Красным выделены области полной гомологии.933.4.2 Эпидемиология и возможная эволюция мобильных элементов,включающих TEM-KPC-комплексАнализ фрагментов представленных в базе ГенБанк (GenBank) показал100% гомологию последовательности на плазмиде pKPAPSS с фрагментомдлиной 3893 п.о., описанную у изолята, выделенного в Сингапуре (GenBank:KC344543.1).Данныйфрагментвключаетобластьюаналогичнуюпоследовательности NG_036720.1, представленную на рисунке 10.
Изолят, укоторого был выделен данный вариант генетического окружения, относитсяк ST841, проведенный авторами анализтипов(Koh et al. 2013)несовместимости плазмид не выявил IncFII группу. Так как ST841 неотноситсякклональномукомплексу147(СС147),можносделатьпредположение, что распространение данного элемента, если исходить изгипотезы о близкой филогении, основанной на отсутствии SNP, происходитчерез перемещение транспозона между плазмидами Enterobacteriacea. Такжев пользу этой гипотезы говорит видовое разнообразие бактерий у которыхбыли выявлены подобные комплексы (табл. 10).Наиболее специфичным фрагментом, близким к гену blaKPC-2, являетсяфрагмент гена blaTEM. Именно сочетание этих двух генов можно назватьмаркером данного варианта окружения, но, на сегодняшний день,недостаточно информации для детального анализа генетического окружениядругихизолятов,включающихданнуюкомбинациюгенов.Последовательность фрагмента гена blaTEM включает специфичные SNP,накоплениекоторыхможетбытьсвязаносотсутствиемотбораработоспособных генов.
Вероятно, аналогичным образом, происходитнакопление SNP в фрагментах гена транспозазы, в который встроилсямобильный элемент с генами устойчивости к макролидам. Характеристикаописанных последовательностей гена blaTEM представлена в таблице 12.94Таблица 12.Характеристика известных фрагментов гена blaTEM в TEM-KPC комплексе всравнении с референсной последовательностью гена blaTEM-1.Вариант окруженияРазмер делецииblaTEM-1K.pneumoniae ИзраильE.coli АргентинаC. freundii АргентинаA.hydrophila КитайK.pneumoniae СингапурK. oxytoca КитайpKPCAPSSE.coli Китай blaKPC-3291 bp291 bp291 bp342 bp342 bp342 bp342 bpПозиция замены (относительноTEM-1)339 (T-A) 344 (T-A)396 (T-G) 643 (G-A)396 (T-G) 643 (G-A)396 (T-G) 643 (G-A)396 (T-G) 643 (G-A)396 (T-G) 643 (G-A)396 (T-G) 643 (G-A)396 (T-G) 549 (G-A) 643 (G-A)Анализ фрагмента гена blaTEM показал три варианта. 1. Делеция 291 п.о.посравнениюсреференснойпоследовательностьюиblaTEM-1двеоднонуклеотидные замены: 396 (T-G) 643 (G-A), делеция 342 п.о.
саналогичными заменами и вариант с делецией 342 п.о., но с дополнительной,третьей заменой, в позиции 549 (G-A). Исходя из этих данных, мы можемвыдвинуть две гипотезы:1. В результате генетических событий TEM-KPC комплекспоявился независимо, в результате транспозиций по Tn3повторам (классический Tn-3 транспозон включает ген blaTEM-1),которые характерны для Tn4401.2.
Мы наблюдаем микроэволюцию минорного варианта мобильногоэлемента, сформировавшегося однократно.В пользу второй гипотезы говорят общие для всех отсеквенированныхвариантов фрагмента гена TEM специфичные SNP. В этом случае, появлениеданного варианта генетического окружения, на сегодняшний день, можносвязать с территорией Израиля, где в TEM-KPC комплексе представленапоследовательностьгенаTEMбезделеции(табл.10).Анаиболееэволюционно отдалённым вариантом, можно назвать вариант выделенный вКитае, включающий ген blaKPC-3. Выравнивание генетического окружения95последовательности с плазмиды pKPAPSS, а также перечисленными двумявариантами представлен на рисунке 10.Присутствие в комплексе TEM-KPC-3 аналогичных SNP комплексуTEM-KPC-2 говорит либо о наличии у фрагмента гена TEM неизвестнойфункции, которая определяет консервативность замен в независимосформировавшихся TEM-KPC комплексах, либо об общих закономерностях,которые приводят к независимому формированию такой конструкции.
Вовсех перечисленных вариантах гена blaTEM (табл. 10), фрагмент начинается споследовательности «ATG», что допускает процесс существования продуктаи может означать наличие у данного гена неизвестной функции, котораяопределяет консервативность замен.96ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯЭпоха применения антибиотиков принесла человечеству, с однойстороны, «большую победу» над бактериальными инфекциями, а с другойсыграла существенную роль в эволюции и формировании новых популяциймикроорганизмов. На примере представителей семейства Enterobacteriaceaeи,вчастности,K.pneumoniae,антибиотикорезистентности.Подможнодействиемпроследитьселективногоэволюциюдействияантибиотиков, предположительно из свободноживущих бактерий, ферментыкарбапенемаз хромосомной локализации попали в популяцию микробиотычеловека уже на интегронах и транспозонах, что обеспечило им быстроераспространение.Массовое распространение карбапенемаз по всему миру, в первуюочередь, среди энтеробактерий, привело к разработке арсенала методов длярутинноговыявлениякарбапенемазнойактивности,фенотипическоготипирования карбапенемаз, а также молекулярной диагностики.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
