Диссертация (Молекулярная характеристика продуцентов карбапенемаз семейства Enterobacteriaceae, выделенных в Санкт-Петербурге), страница 6

2002). После чего молекула β-лактамазы регенерируети способна инактивировать следующую молекулу β-лактамного антибиотика.Эта ферментативная реакция может быть представлена в виде следующегоуравнения:32В этой схеме E – β-лактамаза, S – β-лактамный субстрат, E:S – комплексМихаэлиса (Michaelis complex), E – S – комплекс ацил-фермент, P – продуктлишённый антибактериальной активности. Константы скорости для каждогошага представлены k1, k-1, k2, и k3, k1, и k-1 , являющиеся константамиассоциации – диссоциации комплекса. k2 – константа скорости ацилирования,k3 – константа деацилирования (Drawz and Bonomo 2010). На рисунке 3представлена типовая схема реакции.

После образования комплекса ГенриМихаэлиса (Henri-Michaelis complex), активный сериновый сайт проводитнуклеофильную атаку на карбонильную группу β-лактамного антибиотикачто приводит к образованию высокоэнергетического тетраэдрическогоацилированного продукта. Далее следуют промежуточные переходы наменее энергетически затратную форму ацил-фермент с последующимпротонированием атома азота в молекуле β-лактама и разрыва амидной связи(С-N).

Следующий этап – активированная молекула воды взаимодействует сковалентнымкомплексомвысокоэнергетическогочтоприводиттетраэдрическогокобразованиюдеацилированногопромежуточного продукта. Гидролиз связи между карбоксильной группой икислородом нуклеофильной молекулы серина восстанавливает активностьфермента и освобождает инактивированную молекулу β-лактама (Drawz andBonomo 2010).33Рисунок 2. Предполагаемый механизм реакции β-лактамного субстрата исериновойβ-лактамазы глицин (Glu166) которой участвует вактивации молекулы воды для ацилирования и деацилирования(Meroueh, Fisher et al. 2005). Пунктиром обозначены водородные связи.После активации гидроксильной группы серин (Ser70) проводитнуклеофильную атаку на карбонильную группу β-лактамногоантибиотика с образованием нестабильного промежуточногоацилированного продукта.

Протонирование атома азота в составе βлактамного антибиотика приводит к разрыву связи С-N с образованиемковалентногокомплекса ацил-фермент,который стабильнеепредыдущего комплекса. Атака активной молекулы воды приводит кобразованию деацилированного продукта, с последующим гидролизомсвязи между β-лактамной карбоксильной группы и атомом кислородаSer70. Деацилирование восстанавливает активность фермента.1.7 Основные общественно-значимые карбапенемазыКарбапенемазы представляют наиболее разнообразную группу βлактамаз, превосходящую по спектру активности все другие ферментыгидролизующиеβ-лактамы.Название«карбапенемазы»неотражаетспособности большинства ферментов данной группы гидролизовать почтивсе β-лактамы при сохранении устойчивости, в большом количестве случаев,34к коммерчески доступным ингибиторам β-лактамаз (Queenan and Bush 2007).Карбапенемазы представлены в классах А, В и D, соответственно А и Dотносятся к сериновым ферментам, а класс B включает ферменты с атомамицинка в активном центре.

Класс А включает в себя ферменты SME, IMI,NMC, GES и KPC групп. Класс D включает карбапенемазы OXA-группы, а кметалло-β-лактамазам относятся ферменты NDM, IMP, VIM, SPM, GIM, иSIM.Первые описанные карбапенемазы были видоспецифичными и обладалихромосомной локализацией. Однако, через некоторое время, был описанфермент IMP-1 у Pseudomonas aeruginosa (Watanabe et al. 1991), а такжеOXA-23 у Acinetobacter baumannii (Paton et al. 1993) и KPC-1 у Klebsiellapneumoniae (Yigit et al. 2001). Проблема клонального распространенияустойчивых штаммов сменилась проблемой распространения мобильныхгенетических элементов, несущих детерминанты устойчивости как внутривида, так и между различными видами.На сегодняшний день, наиболее актуальными карбапенемазами длямирового здравоохранения, являются KPC, NDM, OXA, VIM и IMP. Имбудут посвящены отдельные подглавы в порядке хронологии описанияданных ферментов.1.7.1 Карбапенемазы IMP-группыПервоеобнаружениеметалло-β-лактамазы,локализованнойнамобильном генетическом элементе, произошло в 1988 году в Японии.Носителем гена blaIMP-1 была Pseudomonas aeruginosa (Watanabe et al.

1991).Обнаруженный изолят демонстрировал устойчивость на уровне 50 мг/л кимипенему и >400 мг/л к цефтазидиму. Было показано, что данный генлокализован на конъюгативной плазмиде. Через три года данный ген сновабыл выявлен, но уже у Serratia marcescens. Ген blaIMP-1 был локализован на35интегроне третьего класса граничащим с aac(6’)Ib-подобным геном в составекрупной плазмиды около 120 т.п.о.

(Arakawa et al. 1995). В период с 1992 по1994 год в Японии было проведено крупное исследование по выявлениюIMP-положительных изолятов, в результате которого было выявлено 15 IMPположительных P. aeruginosa (Senda et al. 1996). Выявленные изолятыдемонстрировали фенотип устойчивости к имипенему в диапазоне от 2 мг/лдо 128 мг/л, что свидетельствует о дополнительных факторах, влияющих нафенотип, кроме самого приобретения гена устойчивости. В дальнейшем быливыявлены S. marcescens, Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas putida, иKlebsiella pneumoniae, продуцирующие данный ген.

В дальнейшем, ген blaIMP1был выявлен у представителей 16 видов грамотрицательных бактерий всоставе интегрона третьего класса (Shibata et al. 2003). Также были выявленынесколько редких вариантов этого гена blaIMP-3-6 -10.В течение несколькихлет, считалось что металло-β-лактамазы на подвижных мобильных элементах- только японская проблема, пока не были выявлены случаи выявленияферментов IMP-2 и IMP-5 в 1997-98 годах в Португалии и Италии (Cornagliaet al.

1999, Daiyasu et al. 2001). Распространение данных ферментов привело кувеличению доли резистентных к карбапенемным антибиотикам граммотрицательных изолятов в отдельных странах до трёх раз (например, с 6% в1998 году до 19% в 2001 году в Корее) (Lee et al. 2003). На сегодняшний деньгруппа генов blaIMP-типа широко распространена, тем не менее, она остаётсяединственной из наиболее значимых, которая пока не обнаружена натерритории России.1.7.2. Карбапенемазы VIM-группыВпервые карбапенемаза группы VIM была описана в Вероне (Италия) уP. aeruginosa в 1997 году (Lauretti et al.

1999). Ферменты данной группыявляются типичными представителями металло-β-лактамаз, т.е. обладаютактивностью к широкому спектру β-лактамных антибиотиков, но негидролизуют азтреонам, а также ингибируются ЭДТУ. Впоследствии этот ген36был выявлен у Achromobacter xylosoxidans в том же госпитале что и первая P.aeruginosa. Анализ генетической локализации показал, что ген находится нанеконъюгативнойплазмиде,содержащейинтегронпервогокласса,включающего четыре генных кассеты и три различных гена устойчивости каминогликозидам (aacA4, aphA15 и aadA1). Через 3-4 года ген blaVIM-1 былобнаружен в Греции, Франции у E.

coli и K. pneumoniae (Giakkoupi et al.2003). В 1996 году во Франции был описан фермент VIM-2 у P.aeruginosa,гомологичный VIM-1 на 90% (Poirel et al. 2000). РаспространениеP.aeruginosa с геном blaVIM-2 на территории Греции и Испании сталопричиной нескольких внутрибольничных вспышек (Pournaras et al. 2003).Обнаружение в США гена blaVIM-2 связано с небольшой вспышкой вызваннойP. aeruginosa, демонстрирующей чувствительность только к азтреонаму.Гены blaVIM-2 были также обнаружены у Citrobacter frundii в Тайвани, у S.marcescens и Enterbacter cloacae в Южной Корее (Yan, Ko et al. 2002, Yum etal.

2002).Ген blaVIM-4, обнаруженный у E. cloaceae в Санкт-Петербурге (Ageevetset al. 2014), впервые был обнаружен в 2001 году в Греции также у P.aeruginosa (Pournaras et al. 2002). Отличие гена blaVIM-4 от blaVIM-1заключается в одной аминокислотной замене (Ser175Arg). В 2002 году былиобнаружены K. pneumoniae и E. cloaceae несущие этот же ген. Значения МПКу этих изолятов, выделенных у одного пациента, существенно отличались,так у клебсиеллы МПК к имипенему 2 мг/л, а к меропенему 0.5 мг/л, а уэнтеробактера 0.25 и 0.12 мг/л соответственно. Таким образом, значенияМПК могут сильно варьировать у представителей одного семейства (Luzzaroet al.

2004). На сегодняшний день, число вариантов гена blaVIM насчитываетболее десяти генов. Основным резервуаром и наиболее частым носителемэтого гена является P. aeruginosa. Исследования изолятов P. aeruginosa,выделенных на территории России, Казахстана и Белоруссии, показываютувеличениедоликарбапенем-устойчивыхштаммов,продуцирующих37ферменты группы металло-β-лактамаз от 4.5% в 2002 – 2004 году до 28.7% в2010 году. Основным доминирующим сиквенс-типом является ST235,несущий ген blaVIM-2 (Edelstein et al. 2013).1.7.3 Карбапенемазы KPC-группыФермент KPC-1 впервые был описан в 2001 году (Yigit et al. 2001) вСеверной Каролине (США). До сегодняшнего дня, продукция ферментовKPC-типа остаётся основным механизмом устойчивости энтеробактерий ккарбапенемным антибиотикам на территории США (Lee et al.

2009). Первыекрупные вспышки были обнаружены в Нью-Йорке в 2005 году, в течениечетырёх лет выявлялись отдельные случаи продукции фермента KPC (Bratuet al. 2005). Изоляты, ставшие причиной крупных внутрибольничныхвспышек, демонстрировали устойчивость ко всем β-лактамам. Более того, из95 изолятов, собранных в госпиталях Бруклина в 2003-2004 годах, примернополовинадемонстрировалачувствительностькаминогликозидаминекоторые сохранили чувствительность к фторхинолонам (Bratu et al. 2005).Один из примеров роста числа продуцентов KPC-типа выглядит следующимобразом (данные одного из ЛПУ Бруклина) 2002 год – 9%, 2004 – 18%, 2008– 38% (Arnold et al. 2011).

В 2005 году произошло первое обнаружениеферментаKPC-типазапределамиСША–воФранции,носэпидемиологической ссылкой на США, а первая вспышка произошла вИзраиле (Leavitt et al. 2007). На сегодняшний день, KPC-ферментыэндемичны для Израиля и Греции. Ферменты группы KPC широкораспространены по всему миру, в том числе и в Санкт-Петербурге (Ageevetset al. 2014).