Диссертация (Роль HIF1-зависимой регуляции пентозофосфатного пути в обеспечении реакций мозга на гипоксию), страница 2

Однако, патогенез относительно непродолжительных острыхформ гипоксии/ишемии в первую очередь реализуется в период реоксигенации (Nita et al.,2001), когда неконтролируемая активация данного фактора транскрипции на фонедефицита активности киназ, ответственных за обеспечение правильного патттерна посттрансляционных модификаций HIF1 (Chen et al., 2003, Vetrovoy et al., 2015), потенциальноспособна оказывать дезадаптивный эффект, что может вносить неблагоприятный вклад вформирование постгипоксических патологий (Sun Y. et al., 2017). Поэтому вопрос оконкретной роли HIF1 в реализации эффектов тяжелых форм гипоксии также остаетсяоткрытым.71.03. Цель работыЦелью данной работы было изучение молекулярных механизмов, лежащих в основенейропротективного действия гипоксического посткондиционирования при компенсациипоследствий тяжелой гипоксии мозга крыс, и оценить роль HIF1 в реализации эффектовтяжелой гипоксии.Задачи:1.

Исследоватьвлияниегипоксическогопосткондиционированиянаразвитиепроцессов клеточной гибели в гиппокампе и неокортексе крыс, пережившихтяжелую гипоксию.2. Провести сравнительный анализ содержания нейропротективных белков Bcl-2 иBDNF в гиппокампе и неокортексе крыс, переживших тяжелую гипоксию и тяжелуюгипоксию в сочетании с гипоксическим посткондиционированием.3. Сравнить эффекты тяжелой гипоксии и гипоксического посткондиционирования наактивность пентозофосфатного пути и связанные с пентозофосфатным путемпроцессырегуляцииокислительно-восстановительногостатусаисвободнорадикального окисления в гиппокампе и неокортексе крыс.4.

Изучить роль HIF1 в реализации процессов клеточной гибели в гиппокампе крыс,переживших тяжелую гипоксию.5. Определить влияние HIF1 на активность пентозофосфатного пути и связанные спентозофосфатным путем процессы регуляции окислительно-восстановительногостатуса и свободнорадикального окисления в гиппокампе крыс, пережившихтяжелую гипоксию.6.

В модели трехкратной умеренной гипобарической гипоксии проанализироватьвзаимосвязь между активностью HIF1 и транскрипцией ключевого ферментапентозофосфатного пути, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы.81.04. Методология и методы исследованияИсследование молекулярных механизмов адаптивных и патологических реакциймозга на гипоксию и реоксигенацию проведено с использованием разработанной влаборатории регуляции функций нейронов мозга Института физиологии им. И.П.ПавловаРАН модели гипобарической гипоксии in vivo на взрослых самцах крыс линии Wistar весом200-250г в трех режимах: тяжелая повреждающая гипоксия, тяжелая гипоксия в сочетаниис посткондиционированием трехкратной умеренной гипобарической гипоксией, а такжетрехкратная умеренная гипобарическая гипоксия.Решение поставленных задач требовало применения ряда гистохимических,биохимических и молекулярно-биологических методов. Для проверки гипотезы о HIF1зависимой регуляции экспрессии мРНК глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ),ключевого фермента пентозофосфатного пути, использовали HIF1-позитивную модельтрехкратной умеренной гипобарической гипоксии (Samoilov et al., 2015) с последующиманализом количества мРНК Г6ФДГ, нормированной на количество мРНК актина-бета,методом ПЦР в реальном времени.

Для оценки количества и локализации белков интереса(Bcl-2,BDNF,HIF1a,эритропоэтина,Г6ФДГ)былпримененнепрямойABCиммуногистохимический метод, а для проверки качества антител - метод иммуноблоттинг.Для оценки активности Г6ФДГ и измерения количества продукта ПФП, НАДФН, вгиппокампе и неокортексе крыс были использованы коммерческие наборы дляэнзиматического колориметрического анализа в 96-луночных планшетах (Sigma Ald.).

Дляопределения интенсивности процессов свободнорадикального окисления производилиизмерения концентрации продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а именнодиеновых коньюгатов, триеновых коньюгатов, коэффициента Клейна, ТБК-активныхпродуктов, основным представителем которых является малоновый диальдегид (МДА),спектрофотометрическими методами и оснований Шиффа, маркеров взаимодействия МДАс белками, флуориметрическим методом. Количество восстановленных тиоловых групп,свидетельствующее об общем окислительно-восстановительном статусе, определяли припомощи красителя дитионитробензола колориметрическим методом. Количество общегоглутатиона измеряли энзиматическим колориметрическим методом с применениемглутатион редуктазы дрожжей и красителя дитионитробензола.

Для выявленияинтенсивности процессов апоптотической клеточной гибели выделяли ДНК из клетокгиппокампа и производили анализ наличия фрагментации методом электрофореза, а такжеиспользовали гистохимический TUNEL метод для подсчета апоптотических клеток. С9целью оценки вклада HIF1 в изучаемые процессы был использован ингибитор HIF1,топотекан, вводимый внутрибрюшинно за 10 минут до гипоксического сеанса.1.05.

Научная новизнаВ результате проведенных исследований с применением модели умереннойгипобарической гипоксии (УГГ) in vivo в гиппокампе крыс впервые показана обратнаясвязь между активностью HIF1 и транскрипцией Г6ФДГ – первого скоростьлимитирующего фермента пентозофосфатного пути (ПФП).Впервые установлено, что тяжелая гипоксия (ТГ) и последующая реоксигенация,вызывающие краткосрочную гиперэкспрессию регуляторной альфа субъединицы HIF1(HIF1a) в СА1 поле гиппокампа, индуцирует снижение количества и активности Г6ФДГ, атакже количества НАДФН, что сопровождается окислительным стрессом и запускомпроцессов апоптотической клеточной гибели.Приорететными являются результаты, доказывающие, что воздействие на крыс,переживших ТГ, УГГ в режиме ПостК либо инъекция ингибитора HIF1 топотекананепосредственно перед ТГ предотвращают отсроченное уменьшение количества иактивности Г6ФДГ, увеличивая уровень НАДФН, что сопровождается нормализациейокислительно-восстановительного статуса и снижением свободнорадикального окисленияв гиппокампе, а также предотвращением апоптотических процессов.1.06.

Теоретическая и практическая значимость работыПолученные данные расширяют современные представления о молекулярнобиологических процессах, приводящих к развитию постгипоксических патологий, испособствуют пониманию механизмов антиапоптотического и антиоксидантного действиягипоксического посткондиционирования.Практическая значимость работы заключается в том, что полученные намирезультаты могут лечь в основу разработки нейропротективных стратегий при леченииинсультов и других патологий, вызванных кислородной недостаточностью.101.07.

Основные положения, выносимые на защиту1. Посткондиционирование умеренной гипобарической гипоксией оказывает выраженноенейропротективное действие, предотвращая развитие вызванных тяжелой гипоксиейапоптотическихпроцессовиспособствуяувеличениюсодержанияпротивоапоптотического белка Bcl-2 и нейротрофина BDNF в гиппокампе инеокортексе.2. Нарушение функционирования пентозофосфатного пути метаболизма глюкозы вноситсущественный вклад в развитие индуцируемого тяжелой гипоксией окислительногостресса. Посткондиционирование умеренной гипобарической гипоксией способствуетнормализации активности пентозофосфатного пути, предотвращая развитие состоянияокислительного стресса и снижая интенсивность процессов свободнорадикальногоокисления в гиппокампе.3.

Ингибирование HIF1 перед тяжелой гипоксией способствует предотвращению развитиясостояния окислительного стресса и процессов клеточной гибели, что сопровождаетсяувеличением эффективности пентозофосфатного пути в гиппокампе.4. Транскрипционный фактор HIF1 выполняет функцию отрицательного регулятораэкспрессии гена ключевого фермента пентозофосфатного пути, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Трехкратная умеренная гипобарическая гипоксия вызывает увеличениетранскрипции мРНК глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы в гиппокампе.111.08.

Апробация результатовРезультаты получены с помощью современных биохимических и молекулярнобиологических методов. Объем выборок и число независимых экспериментов позволилиоценить значимость результатов после обработки с помощью адекватных методовстатистического анализа. Результаты работы были представлены на следующихконференциях:1) 16я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наукаXXI века", г. Пущино, 16-21.04.2012;2) Всероссийская конференция молодых ученых «Актуальные вопросы биологии и химии»,г.

Пущино, 30.07-3.08.20123) 17я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наукаXXI века ", г. Пущино, 22-26.04.20134) III Научно-практическая конференция молодых ученых РАН «Фундаментальная иприкладная наука глазами молодых ученых. Успехи, перспективы, проблемы и пути ихрешения», г. Санкт-Петербург, 5-7.06.135) ХХII съезд физиологического общества им. И.П. Павлова, г. Волгоград, 16-20.09.20136) XVII научная школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервнойдеятельности и нейрофизиологии, г.

Москва, 21-23.10.137) Международный симпозиум «Биохимия – основа наук о жизни», г. Казань, 21-23.11.138)Всероссийскаямедико-биологическаянаучнаяконференция молодыхученых«Фундаментальная наука и клиническая медицина», г. Санкт-Петербург, 19.04.20149) 18я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "биология - наукаXXI века", г.

Пущино, 21-26.04.201410) Всероссийская конференция с международнымучастием«Нейрохимическиемеханизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», г. СанктПетербург, 24-26.06.201411) Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическаябиофизика», г.Пущино, 27-29.10.201412) XVIII научная школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервнойдеятельности и нейрофизиологии, г.Москва, 28-29.10.20141213) Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых ученых«Фундаментальная наука и клиническая медицина», г.

Санкт-Петербург, 18.04.201514) 19я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "биология наука XXI века", г. Пущино, 20-24.04.201515) Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных«Ломоносов - 2015», г.Москва, 13-17.04.201516) ESN Conference on Molecular Mechanisms of Regulation in the Nervous System, Tartu,Estonia, 14-17.06.1517) IX Всероссийская конференция «Нейроэндокринология – 2015», г.Санкт-Петербург,27-29.10.1518) Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическаябиофизика», г.Пущино, 2-3.11.201519) Международная научная конференция Научного Парка СПбГУ «трансляционнаябиомедицина: современные методы междисциплинарных исследований в аспектевнедрения в практическую медицину», г.Санкт-Петербург, 10-12.11.2015.20) Всероссийская конференция с международным участием «Современные проблемыфизиологии высшей нервной деятельности, сенсорных и висцеральных систем», г.СанктПетербург, 8-10.12.201521) Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных«Ломоносов - 2016», г.Москва, 11-15.04.201622) 20я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология наука XXI века", г.