Диссертация (Роль HIF1-зависимой регуляции пентозофосфатного пути в обеспечении реакций мозга на гипоксию), страница 9

Цитозольный Bid, подвергаясьограниченному протеолизу каспазой-8, переходит в активную форму, способную квстраиванию в митохондриальную мембрану и инактивации Bcl-XL. Bax и Bimперемещаются в митохондриальную мембрану в ответ на внеклеточный сигнал клеточнойсмерти, либо на отсутствие сигнала от факторов роста. Bcl-2 блокирует активность Bax, носам может быть инактивирован Bim (продукт транскрипционной активности c-Jun и FoxO1)и рядом других проапоптотических белков (Puma,Noxa – их транскрипция активируется p53(Brenner et al., 2009, Halestrap et al., 2010).Высвободившийся из митохондрии цитохром С взаимодействует с локализованнымв цитоплазме белком Apaf-1.

Предполагается, что связывание цитохрома С изменяетконформацию Apaf-1, в результате чего CARD-домен становится доступен для связываниясгомологичнымдоменомпрокаспазы-9.Формируетсяолигомерныйкомплекс(апоптосома), состоящий из нескольких молекул Apaf-1, цитохрома С и прокаспазы-9, врезультате чего молекулы прокаспазы-9 тесно сближаются, и происходит ограниченныйпротеолиз прокаспазы-9 до активной каспазы-9, активирующей в свою очередь каспазу-3,которая запускает апоптоз опосредованно активацией нуклеазы CAD, осуществляющейфрагментацию ДНК. Хотя механизмы, регулирующие проницаемость митохондриальноймембраны и освобождения цитохрома С при апоптозе полностью не понятны, Bcl-XL, Bcl2 и Bax могут повлиять на потенциал-зависимый анионный канал (VDAC), который,видимо, играет роль в регуляции выхода цитохрома С (Pradelli et al., 2010).Данные о вовлечении Bcl-2 в реализацию нейропротекции были получены в моделираннего ишемического ПостК (Xing et al., 2008).

Регуляция транскрипции Bcl-2осуществляется адаптивными транскрипционными факторами CREB, NF-кB (Chatagner etal., 2010, Jonassen et al., 2001). Мобилизация CREB (за счет фосфорилирования) былапродемонстрирована при изучении эффекта ишемического (Hara et al., 2003) игипобарического (Чурилова и др., 2009) прекондиционирования. Следует отметить, что42гипоксическое прекондиционирование, какишемическое,такигипобарическое,увеличивало экспрессию NF-кB, хотя тяжелая гипоксия/ ишемия приводила к снижениюего экспрессии (Чурилова и др., 2009, Blondeau et al., 2001).

Накопленные в настоящее времяданныесвидетельствуютотом,чтоBcl-2являетсяудобнымкоррелятомадаптивного/патологического статуса клеток вообще, а в частности нейронов.2.05.04. Нейротропный фактор мозга (BDNF)Все ростовые факторы представляют собой полипептиды, состоящие из 100-150аминокислотных остатков. Нейротрофины – семейство факторов роста, осуществляющихсвою функцию главным образом в нервной системе. Все они синтезируются в видепредшественников (примерно 33кДа).

Затем в ходе посттрансляционного процессингавыщепляются активные пептиды, содержащие несколько высоко консервативных остатковцистеина, образующих дисульфидные мостики при формировании третичной структуры.Нейрональные ростовые факторы необходимы для развития и поддержания нервнойсистемы за счет обеспечения выживаемости определенных типов нейронов и клеток глии(благодаря подавлению активности проапоптотического белка Bad опосредованнозапуском Akt и Erk1/2 сигналинга), регуляции формирования специфического фенотипанервных клеток, участия в образовании определенного рецепторного аппарата и типаэргичности (отдельными нейротрофинами или их совместным действием). В нервнойсистеме взрослого организма ростовые факторы обеспечивают формирование синапсов,поддерживают пластичность нейронов и участвуют в регенеративных процессах.Семейство нейротрофинов включает в себя NGF (фактор роста нервов), BDNF(нейротропный фактор мозга), NT3 (нейротрофин-3), и NT4/5 (нейротрофин-4/5).

Разныенейротрофины имеют различные места преимущественной реализации их действия. Такдля NGF основными клетками-мишенями являются симпатические и сенсорные нейроны вПНС, холинэргические нейроны базального переднего мозга и стриатума, а также клеткиПуркинье мозжечка в ЦНС, для BDNF – сенсорные нейроны в ПНС, спинальныемотронейроны, дофаминэргические нейроны черной субстанции, глутаматэргическиенейроны гиппокампа и ганглиозные клетки сетчатки в ЦНС (Ещенко и др., 2013).Функции нейротрофинов опосредуется путем взаимодействия с тирозинкиназнымирецепторами: NGF с TrkA, BDNF и NT4/5 с TrkB, NT3 с TrkC и в меньшей степени с TrkA,TrkВ. В структуре рецептора выделяют три участка: экстраклеточный с сайтом связывания43лиганда (содержит два богатых цистеином и один богатый лейцином домены, а такжеиммуноглобулиновый домен), трансмембранный (22-26 а.о., низкая гомология даже впределах семейства), внутриклеточный с тирозинкиназным доменом на С конце (высококонсервативный) и сайтами аутофосфорилирования.

Специфичность лиганд-рецепторноговзаимодействия определяется вариабельностью экстраклеточного участка рецептора(Ещенко и др., 2013).Связавшись с лигандом димеризовавшийся рецептор аутофосфорилируется, чтоприводит к ассоциации с белками мишенями, эндоцитируется и, перемещаясьретроградным транспортом к ядру, запускает несколько сигнальных путей. Мишенямирецепторов нейротрофинов являются такие молекулы цитозоля чувствительных нейроновкак фосфолипаза С, IAPs (ингибитор апоптоза) и киназа Akt (опосредованно PI3K), белкиRas-MAP киназного пути, приводящего к активации адаптивного транскрипционно фактораCREB, запускающего транскрипцию противоапоптотического белка Bcl-2, пептидныхантиоксидантов, NGFI (фактора транскрипции, индуцирующего NGF) (Howe et al., 2001).Кроме высокоаффинных Trk-рецепторов обнаружен общий для всех нейротрофиновнизкоаффинный (паннейротрофиновый) рецептор р75.

В отличие от остальных Trkрецепторов он не имеет тирозинкиназной активности, но на внутриклеточном участке несетдомен, активирующий церамидный путь передачи сигнала запуска апоптоза.BDNF, как и другие нейротрофины, является полипептидным фактором (13,6 кДа),ответственнымзапролиферациюнейронов,дифференцировкуивыживание,синаптическую пластичность и процессы памяти и научения. Высоко консервативен,способен димеризоваться с образованием активной формы.

Содержание BDNF вструктурах мозга млекопитающих значительно выше, чем NGF (Ещенко и др., 2013).Высока экспрессия BDNF в гиппокампе и коре головного мозга. Его клеточноедействие осуществляется через два типа рецепторов: высоко аффинные TrkB и низкоаффинные рецепторы p75. Секретируемый нейронами и астроцитами BDNF воздействуетна нейроны через активации рецептора на мембране аксона. Связывание BDNF инициируетдимеризацию TrkB и аутофосфорилирование остатков тирозина на цитоплазматическомдомене (Рисунок 4).44Рисунок 4.

Обобщенная схема представлений о сигнальных путях, активируемыхсвязыванием BDNF с TrkB (http://www.qiagen.com). Пояснения в тексте.Фосфорилированныеостаткитирозинастановятсясайтамисвязыванияцитоплазматических сигнальных и структурных белков по SH2 домену. Происходитиндукциясборкиклатриновогоопушенияимикротрубочек,опосредующаяинтернализацию BDNF-рецепторного комплекса и ретроградный транспорт в тело нейронас последующей активацией множества мишеней (Bariohay et al., 2005)45Связывание комплекса GRB2 по SH2 домену приводит к активации ГТФазы Ras (Stenqvistet al., 2005).

Ras, в свою очередь, активирует PI3K и c-Raf/ MEK/ERK1/2 путь. PI3K можетбыть также активирована через адаптерные белки SHC и Gab1. PI3K непосредственнорегулирует определенные пути выживания клетки путем активации киназы Akt. Средимишеней ERK1/2 индуцибельный транскрипционный фактор c-Fos, регулятор еготранскрипции CREB, HIF1a и другие (Ying et al., 2002).Регуляция транскрипции BDNF осуществляется адаптивными транскрипционнымифакторами CREB, NF-кB (Herdegen et al., 1998, Knapska et al., 2004). Также обнаруженымеханизмы контроля экспрессии BDNF на уровне трансляции: при итенсивной стимуляцииглутаматныхNMDAрецептороввходящийкальцийактивируетeEF2киназу,фосфорилирующую эукариотический фактор элонгации 2, приводя к его инактивации и,следовательно, остановке трансляции.

Блокада NMDA рецепторов кетамином upрегулировала трансляцию BDNF (Lester et al., 2012), что отражено на Рисунке 5.Рисунок 5. Схема, демонстрирующая опосредованный кальцием контроль трансляцииBDNF в дендритах глутаматэргических нейронов (А), влияние блокады NMDA рецепторовкетамином на трансляцию BDNF (В) (Lester et al., 2012).Таким образом, литературные данные указывают на то, что белок BDNF играетключевую роль в регуляции процессов гибели/выживания нейронов мозга вообще, а такжеможетбытьзадействованывреализациинейропротективногопосткондиционирования умеренной гипобарической гипоксией, в частности.действия462.06. Пентозофосфатный путь как ключевой регулятор антиоксидантных функцийНа основании косвенных данных об эффектах умеренной гипоксии, а именно освязанной с гипоксией резистентности опухолевых клеток к радиотерапии (Meijer et al.,2014), нами было сделано предположение о том, что среди мишеней регуляциигипоксией/реоксигенацией важную роль может занимать пентозофосфатный путь (ПФП)метаболизма глюкозы.

Важной особенностью данного метаболического пути является то,что его ферменты (в большей степени глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ),являющаяся первым скорость-лимитирующим ферментом ПФП, но такжже и 6фосфоглюконатдегидрогеназа)являютсявмозгеосновнымигенераторамивосстановленного НАДФ (Ulusu et al., 2003), существенно превосходя по эффективностиальтернативные малик-энзимный и изоцитрат дегидрогеназный пути (Ещенко и др., 2013).В связи с тем, что без НАДФН невозможно восстановление таких антиоксидантов кактиоредоксины и глутатион (Dringen, 2000, Fernandez-Fernandez et al., 2012, Cheng et al., 2009,Deponte, 2013), ПФП играет ведущую роль в обеспечении эффективности антиоксидантныхсистем мозга и поддержания нормального окислительно-восстановительного статусаклетки.

На Рисунке 6 представлена схема вовлечение этого метаболического пути вобеспечение эффективной антиоксидантной защиты мозга.Рисунок 6. Обобщенная схема представлений о вовлечении пентозофосфатного пути впроцессы функционирования глутатионовой антиоксидантной системы мозга (FernandezFernandez et al., 2012).47Так как в основе постгипоксического/ишемического повреждения клеток мозгалежит сопряженная с реоксигенацией/реперфузией чрезмерная генерация АФК и, какследствие, каскадное свободнорадикальное повреждение макромолекул, ведущее к запускуапоптотических процессов и сопровождающее некротическим повреждением (Maiti et al.,2006, Nita et al., 2001, Sugawara & Chan, 2003, Sanderson et al., 2013), поддержаниепроцессивности систем утилизации АФК критично для реализации защитных функций.В связи с этим вопрос о вовлечении ПФП в обеспечение защитных реакций мозга нагипоксию и последующую реоксигенацию является крайне важным как для пониманияэндогенных механизмов адаптации мозга, так и представляет собой перспективноенаправление для таргетной терапии постгипоксических состояний.

Поэтому изучениевозможной взаимосвязи между гипоксией/реоксигенацией в различных режимах,ключевым регулятором клеточного ответа на гипоксию, HIF1, пентозофосфатным путем иопосредованными им функциями оказалось в центре внимания при выполнении настоящейработы.483. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.01. МатериалыРабота выполнена на взрослых самцах крыс линии Wistar весом 220-240г (n=441) изБиоколлекции Института Физиологии им.