Диссертация (Роль HIF1-зависимой регуляции пентозофосфатного пути в обеспечении реакций мозга на гипоксию)

Федеральное Государственное Бюджетное ОбразовательноеУчреждение Высшего Образования«Санкт-Петербургский Государственный Университет»На правах рукописиВетровой Олег ВасильевичРОЛЬ HIF1-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ ПЕНТОЗОФОСФАТНОГО ПУТИ ВОБЕСПЕЧЕНИИ РЕАКЦИЙ МОЗГА НА ГИПОКСИЮ03.01.04 – БиохимияДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биологических наук, профессорЕщенко Наталья ДмитриевнаСанкт-Петербург20182ОГЛАВЛЕНИЕ1.Введение…………………………………………………………………………………….51.01. Актуальность темы исследования…………………………………………………….51.02.

Степень разработанности темы исследования……………………………………….61.03. Цель работы…...………………………………………………………………………..71.04. Методология и методы исследования………………………………………………...81.05. Научная новизна………………………………………………………………………..91.06. Теоретическая и практическая значимость работы…………………………………..91.07. Основные положения, выносимые на защиту………………………………………101.08. Апробация результатов………………………………………………………………111.09. Личное участие автора в получении результатов…………………………………...161.10.

Структура и объем диссертации……………………………………………………..161.11. Финансовая поддержка и благодарности……………………………………………162.Обзор литературы…………………………………………………………………………182.01. История изучения гипоксии………………………………………………………….182.02. Понятие о гипоксии и механизмах ее негативного действия на мозг……………..192.03. Молекулярно-клеточные механизмы нейропротекции, индуцируемой умереннойгипобарической гипоксией…………………………………………………………...232.04.

Гипоксическое/ишемическое посткондиционирование……………………………262.04.01.Нейропротективныемеханизмы,активируемыеишемическимпосткондиционированием………………………………………………………………...282.04.02. Неинвазивные способы посткондиционирования……………………………...312.04.02.01. Гипоксическое посткондиционированиеумеренной гипобарическойгипоксией…………………………………………………………………………………..322.04.02.02.Механизмынейропротективныхэффектовнормобарическогогипоксического посткондиционирования……………………………………………….332.05.

Предполагаемые эффекторы нейропротекции, индуцируемой гипоксическимпосткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией………………...352.05.01. Гипоксия-индуцируемый фактор (HIF1)………………………………………..352.05.02. Цитокин эритропоэтин…………………………………………………………..382.05.03. Bcl-2 и регуляция апоптоза, опосредуемого митохондриями…………………402.05.04. Нейротропный фактор мозга (BDNF)…………………………………………...422.06. Пентозофосфатный путь как ключевой регулятор антиоксидантных функций…..4633.Материалы и методы исследования………………………………………………………483.01.

Материалы…………………………………………………………………………….483.02. Модель гипобарической гипоксии………………………………………………….483.02.01. Режим тяжелой повреждающей гипоксии……………………………………...493.02.02. Режим посткондиционирования умеренной гипобарической гипоксией…….503.02.03. Режим трехкратной умеренной гипобарической гипоксии……………………503.03. Постановка экспериментов с использованием ингибитора HIF1…………………513.04. Гистохимические методы…………………………………………………………….513.04.01. Гистологическая обработка ткани и изготовление парафинизированных срезовмозга………………………………………………………………………………………..513.04.02.

Иммуногистохимический метод детекции белков……………………………..523.04.02.01. Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга………………………523.04.02.02.Количественнаяобработкарезультатовиммуногистохимическогоокрашивания с использованием системы компьютерного анализа изображений……..543.04.03. Детекция апоптотических клеток методом TUNEL……………………………553.05. Иммуноблоттинг……………………………………………………………………...563.05.01. Пробоподготовка…………………………………………………………………563.05.02. Определение концентрации белка по методу Бредфорда……………………...573.05.03. Электрофорез белков в ПААГ по методу Лэммли……………………………...573.05.04. Электроперенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану…………...583.05.05.

Иммунодетекция белков на мембране…………………………………………..583.06. Выделение и электрофоретический анализ фрагментации ДНК для определенияинтенсивности процессов клеточной гибели………………………………………...603.07. Спектрофотометрический метод определения содержания общего белка………..603.08. Определение активности Г6ФДГ…………………………………………………….613.09. Определение количества НАДФН…………………………………………………...623.10. Экстракция цитозольной фракции из гиппокампа и неокортекса крыс…………...633.11. Измерение содержания восстановленных тиоловых групп и общего глутатиона...633.11.01. Измерение содержания тиоловых групп………………………………………..643.11.02. Определение содержания общего глутатиона………………………………….653.12.

Измерение количества продуктов перекисного окисления липидов………………663.12.01. Анализ диеновых, триеновых конъюгатов и коэффициента Клейна………….663.12.02. Измерение количества оснований Шиффа……………………………………...663.12.03. Определение количества фосфора общих фосфолипидов……………………..673.12.04. Определение количества ТБК-активных продуктов…………………………...6743.13. Количественный анализ транскрипции Г6ФДГ методом ПЦР в реальном времени….683.14. Статистическая обработка результатов…………………………………………………694.Результаты и обсуждение…………………………………………………………………704.01. Эффектытяжелойгипоксииитяжелойгипоксиивсочетанииспосткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией на гиппокамп инеокортекс крыс……………………………………………………………………….704.01.01. Анализ процессов клеточной гибели……………………………………………704.01.01.01.

Изучение динамики фрагментации ДНК…………………………………….704.01.01.02. Изучение количества TUNEL позитивных клеток………………………….714.01.02. Содержание проадаптивных белков Bcl-2 и BDNF…………………………….734.01.03. Иммуногистохимический анализ содержания HIF1a и Г6ФДГ……………….784.01.03.01. Содержание HIF1a в СА1 поле гиппокампа и втором слое неокортекса…..784.01.03.02. Содержание Г6ФДГ в СА1 поле гиппокампа и втором слое неокортекса…814.01.04. Анализ активности Г6ФДГ и количества НАДФН……………………………..824.01.05. Анализ окислительно-восстановительного статуса и количества общегоглутатиона…………………………………………………………………………………844.01.06. Определение интенсивности процессов перекисного окисления липидов…...874.02.

Изучение роли HIF1 в реализации эффектов тяжелой гипоксии в гиппокампекрыс…………………………………………………………………………………….894.02.01. Количество TUNEL позитивных клеток в СА1 поле гиппокампа……………..894.02.02. Содержание HIF1a, эритропоэтина и Г6ФДГ в СА1 поле гиппокампа………..914.02.03. Анализ активности Г6ФДГ и количества НАДФН……………………………..964.02.04. Анализ окислительно-восстановительного статуса, количества общегоглутатиона и оснований Шиффа………………………………………………………….974.03.

Использование модели трехкратной умеренной гипобарической гипоксии дляанализа роли HIF1 в регуляции транскрипции мРНК Г6ФДГ……………………....995.Заключение……………………………………………………………………………….1016.Выводы…………………………………………………………………………………...1047.Список сокращений……………………………………………………………………...1058.Список литературы………………………………………………………………………10651. ВВЕДЕНИЕ1.01. Актуальность темы исследованияНарушение кислородного снабжения мозга рассматривается в настоящее время какключевой фактор в развитии множества неврологических заболеваний.

Тяжелые формыгипоксического стресса, такие как ишемический инсульт, представляют собой одну из самыхраспространенных причин смерти и снижения качества жизни. Поэтому поиск путейповышения устойчивости мозга к гипоксии/ишемии представляет собой одну изважнейших задач современной биологии и медицины. Основные подходы для решения этойзадачи включают не только разработку новых лекарственных средств, но и использованиенемедикаментозных методов мобилизации эндогенных защитных механизмов (Самойлов идр., 2012).

Особого внимания среди таких немедикаментозных методов заслуживаетпосткондиционирование (ПостК) - предъявление экстремальных воздействий умереннойинтенсивности особям, пережившим тяжелое повреждающее воздействие (Zhao et al.,2003).Настоящее исследование направлено на изучение механизмов нейропротективногодействия гипоксического посткондиционирования, а также на расширение представленийо механизмах метаболических перстроек мозга, лежащих в основе патологических иадаптивных реакций на гипоксию и реоксигенацию.

В фокусе нашего внимания была рольгипоксия-индуцируемого фактора-1 (HIF1) в регуляции пентозофосфатного пути (ПФП)метаболизма глюкозы – основного источника НАДФН в мозге. В связи с тем, что безНАДФН невозможно восстановление таких антиоксидантов как тиоредоксины и глутатион,ПФП представляет собой ключевой регулятор эффективности антиоксидантных системмозга. Поскольку опосредованная гипоксией гибель нейронов осуществляется с участиемактивных форм кислорода (АФК), изучение вопроса о возможной взаимосвязи междугипоксией/реоксигенацией в различных режимах, ключевым регулятором клеточногоответа на гипоксию, HIF1, пентозофосфатным путем и опосредованными им функциямиявляется крайне важным как для понимания эндогенных механизмов адаптации мозга, таки для разработки подходов к таргетной терапии постгипоксических состояний.61.02.

Степень разработанности темы исследованияРанее в лаборатории регуляции функций нейронов мозга Института физиологии им.И.П.Павлова РАН был разработан неинвазивный способ коррекции последствий тяжелойповреждающей гипоксии мозга сеансами умеренной гипобарической гипоксии (УГГ) воздействия на организм пониженным атмосферным давлением, приводящим кослаблению кислородного снабжения (патент РФ №2437164.). В моделях на крысахпоказано,чтопосткондиционирование(ПостК)трехкратнойУГГэффективнопредотвращает индуцируемую тяжелой гипоксией гибель нейронов гиппокампа инеокортекса, способствует функциональной реабилитации после тяжелой гипобарическойгипоксии (ТГ) или психоэмоциональных стрессов, нормализуя активность гипоталамогипофизарно адренокортикальной системы и поведение у крыс (Rybnikova et al., 2012).

Приэтом в отличие от ишемических моделей (Gao et al., 2008), нейропротекция наблюдаетсядаже в тех случаях, когда посткондиционирование производится в отдаленный периодпосле повреждающего воздействия (1-3 дня). Однако, помимо описательных данных,информации о конкретных механизмах реализации протективного действия ПостК УГГ насегодняшний день недостаточно.Рольключевогорегулятораадаптациикгипоксииотводитсягипоксия-индуцируемому фактору-1 (HIF1), в связи с чем в мировой литературе активно обсуждаетсявозможность фармакологической активации HIF1 с целью терапии, в частности,постинсультных состояний.