Автореферат (Роль HIF1-зависимой регуляции пентозофосфатного пути в обеспечении реакций мозга на гипоксию), страница 2

Практическая значимость работы заключается в том, чтополученные нами результаты могут лечь в основу разработки нейропротективныхстратегий при лечении инсультов и других патологий, вызванных кислороднойнедостаточностью.Методология и методы исследования. Исследование молекулярныхмеханизмов адаптивных и патологических реакций мозга на гипоксию иреоксигенацию проведено с использованием разработанной в лабораториирегуляции функций нейронов мозга Института физиологии им. И.П.Павлова РАНмодели гипобарической гипоксии in vivo на взрослых самцах крыс линии Wistarвесом 200-250г в трех режимах: тяжелая повреждающая гипоксия, тяжелая гипоксияв сочетании с посткондиционированием трехкратной умеренной гипобарическойгипоксией, а также трехкратная умеренная гипобарическая гипоксия.

Решениепоставленных задач требовало применения ряда современных биохимических,молекулярно-биологических и гистохимических методов.Положения, выносимые на защиту:1. Посткондиционирование умеренной гипобарической гипоксией оказываетвыраженное нейропротективное действие, предотвращая развитие вызванныхтяжелой гипоксией апоптотических процессов и способствуя увеличениюсодержания противоапоптотического белка Bcl-2 и нейротрофина BDNF вгиппокампе и неокортексе.2. Нарушение функционирования пентозофосфатного пути метаболизма глюкозывносит существенный вклад в развитие индуцируемого тяжелой гипоксиейокислительного стресса. Посткондиционирование умеренной гипобарическойгипоксией способствует нормализации активности пентозофосфатного пути,предотвращая развитие состояния окислительного стресса и снижаяинтенсивность процессов свободнорадикального окисления в гиппокампе.3.

Ингибирование HIF1 перед тяжелой гипоксией способствует предотвращениюразвития состояния окислительного стресса и процессов клеточной гибели, что6сопровождается увеличением эффективности пентозофосфатного пути вгиппокампе.4. Транскрипционный фактор HIF1 выполняет функцию отрицательного регулятораэкспрессии гена ключевого фермента пентозофосфатного пути, глюкозо-6фосфат дегидрогеназы. Трехкратная умеренная гипобарическая гипоксиявызывает увеличение транскрипции мРНК глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы вгиппокампе.Степень достоверности и апробации результатов.

Результаты получены спомощью современных методов. Объем выборок и число независимыхэкспериментов позволили оценить значимость результатов после обработки спомощью адекватных методов статистического анализа. Результаты работы былипредставлены и обсуждены на 37 конференциях, в частности: ESN Conference onMolecular Mechanisms of Regulation in the Nervous System (Tartu, Estonia, 1417.06.15), FENS Forum of Neuroscience (Copenhagen, Denmark, 2-6.07.2016),International Symposium on Metabolic and redox interactions between neurons andastrocytes in health and disease (Salamanca, Spain, 26-28.06.2017), ISN-ESN Meeting(Paris, France, 20-24.08.2017).Публикации.

По теме диссертации опубликовано 67 работ, из них 10 статей врецензируемых журналах, 7 из которых – статьи в рецензируемых журналах,рекомендованных ВАК РФ, 57 тезисов конференций.Личный вклад соискателя. Личный вклад диссертанта состоял в анализелитературы по проблеме исследования, разработке гипотезы, планированииэкспериментов и их выполнении, статистической обработке полученныхрезультатов, обсуждении результатов, подготовке публикаций по теме диссертации.Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме исодержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методыисследования», «Результаты и обсуждение», «Заключение» «Выводы», «Списоксокращений», «Список литературы», включающий 154 источников, из них 22 –отечественных.

Диссертация изложена на 118 страницах. Результаты и обсуждениепредставлены на одной таблице и иллюстрированы 34 рисунками.Финансовая поддержка. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №13-04-00532, 16-04-00987, 16-34-00027.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫМатериалы. Работа была проведена на взрослых самцах крыс линии Wistarвесом 200-250г из Биоколлекции Института Физиологии им.

И.П. Павлова РАН. Всеизмерения проведены с использованием материалов минимум из двух независимыхэкспериментов. В каждой экспериментальной группе (контрольной или опытной) накаждой временной точке использовано не менее 6 животных. Для исследованийвыбраны гиппокамп и сенсомоторная кора, так как эти структуры мозга признанынаиболее чувствительными к гипоксии и последующей реоксигенации (Kumar et al.,2016).7Гипобарическая гипоксия. Для создания условий повреждающей гипоксиииспользована модель тяжелой гипобарической гипоксии (ТГ) - трехчасовой сеанспребывания крыс при 180 мм.рт.ст. (5% О2) (Rybnikova et al., 2006). Для оценкиэффектов посткондиционирования (ПостК) животных подвергали ТГ в сочетании ссеансами умеренной гипобарической гипоксии (УГГ) (360 мм.рт.ст., 10% О2) - 3двухчасовых воздействия с интервалом 24 часа между сеансами и после завершенияТГ) (Rybnikova et al., 2012).

Для проверки гипотезы о HIF1-зависимой регуляцииэкспрессии гена глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ) в гиппокампеиспользовали HIF1-позитивную модель трехкратной УГГ (Samoilov et al. 2015).С целью оценки роли транскрипционного фактора HIF1 в изучаемых процессахиспользовали ингибитор трансляции HIF1 - топотекан (Ban et al., 2011, Rapisardaet al., 2009). Топотекан растворяли в смеси ДМСО:0,09 % NaCl и вводили животнымвнутрибрюшинно (5мг/кг веса) за 10 минут до каждого гипоксического сеанса(группы тяжелая гипобарическая гипоксия + ингибитор (ТГ+HIF1i) либотрехкратная умеренная гипобарическая гипоксия + ингибитор (3УГГ+HIF1i)).

Вкачестве инъекционного контроля использовали смесь ДМСО:0,09 % NaCl (группыТГ, ТГ + посткондиционирование (ПостК) либо 3УГГ). Не подвергавшимсягипоксическим воздействиям крысам также вводили топотекан для ингибированияHIF1 (Контроль+HIF1i) либо смесь ДМСО:0,09 % NaCl (Контроль).Для выявления интенсивности процессов апоптотической клеточной гибеливыделяли ДНК из клеток гиппокампа и неокортекса и производили анализ наличияфрагментации электрофоретическим методом, а также использовалигистохимический метод TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick endlabelingdUTPконцевоемечениеДНКтерминальнойдезоксинуклеотидилтрансферазой) для подсчета апоптотических клеток.Для оценки количества и локализации белков интереса (Bcl-2, BDNF, HIF1a,эритропоэтин, Г6ФДГ) в СА1 поле гиппокампа и втором слое сенсомоторной корыбыл применен непрямой ABC иммуногистохимический метод, а для проверкиселективности используемых антител - метод вестерн блотт.Измерения активности Г6ФДГ и количества продукта пентозофосфатного пути,НАДФН, в экстрактах гиппокампа и неокортекса проводили, используякоммерческие наборы для энзиматического колориметрического анализа в 96луночных планшетах (Sigma Ald.).Количество восстановленных тиоловых групп, свидетельствующее об общемокислительно-восстановительном статусе, определяли в цитозольной фракциигиппокампа и неокортекса при помощи реактива Эллмана колориметрическимметодом.Количество общего глутатиона измеряли в цитозольной фракции гиппокампа инеокортекса энзиматическим колориметрическим методом с применениемглутатион редуктазы дрожжей и реактива Эллмана.Для определения интенсивности процессов свободнорадикального окисленияпроизводили выделение липофильной фракции гиппокампа и неокортекса иизмеряли количество продуктов перекисного окисления липидов (диеновых и8триеновых коньюгатов) спектрофотометрическим методом и оснований Шиффафлуориметрическим методом в 96-луночных планшетах.Роль HIF1 в регуляции транскрипции гена Г6ФДГ оценивали с использованиемметода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.РЕЗУЛЬТАТЫВлияние тяжелой гипоксии и тяжелой гипоксии в сочетании спосткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией на процессыклеточной гибели в гиппокампе и неокортексе крыс.

С целю изучения влияниятяжелой гипобарической гипоксии на процессы клеточной гибели в гиппокампе инеокортексе крыс, а также оценки нейропротективного потенциала гипоксическогопосткондиционирования использовали два метода: электрофоретический анализфрагментации ДНК и гистохимический метод выявления апоптотических клеток.Фрагментация ДНК в гиппокампе крыс выявлена уже через два дня послеокончания сеанса ТГ (Рисунок 1, А). При этом по крайней мере в течение четырехдней после ТГ фрагментация ДНК остается на высоком уровне.

Напротив, вгиппокампе животных, переживших ТГ в сочетании с сеансами гипоксическогоПостК, фрагментация ДНК не выявлена, что указывает на наличиепротивоапоптотического эффекта ПостК (Рисунок 1, А) для этой структуры мозга.Рисунок 1. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с сеансамипосткондиционирования (ТГ+ПостК) на фрагментацию ДНК в гиппокампе (А) и неокортексе (Б)крыс (электрофоретическое разделение в 2% агарозе; количество ДНК в каждой пробе: 5мкг).В отличие от гиппокампа, в неокортексе как посткондиционированных крыс, таки животных, переживших ТГ без ПостК, не выявлено изменения фрагментации ДНКпо сравнению с контролем (Рисунок 1, Б), что указывает на меньшуючувствительность неокортекса крыс к повреждающему действию ТГ по сравнению сгиппокампом, либо на повышенную регенеративную способность данной структурымозга.9Гистохимическим методом анализа апоптотических процессов по соотношениюTUNEL-позитивных клеток к общему количеству клеток не выявленоапоптотических процессов в течение первых трех дней после ТГ.

Через 4 дня послереоксигенации в CA1 поле гиппокампа крыс наблюдаются ярко выраженныеапоптотические процессы (Рисунок 2). Во втором слое сенсомоторной коры крысэтой группы апоптотические клетки также присутствуют, однако их существенноменьше, чем в гиппокампе.Рисунок 2. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с тремя сеансамигипоксического посткондиционирования (ТГ+3ПостК) на количество TUNEL-позитивных клеток.Микрофотографии (40х) СА1 поля гиппокампа (А) и второго слоя неокортекса (Б) контрольныхкрыс (Контроль), через 4 дня после тяжелой гипоксии (ТГ+4дня) и через день после тяжелойгипоксии в сочетании с трехкратным посткондиционированием умеренной гипобарическойгипоксией (ТГ+3ПостК+1день). Маркер, 100 мкм.ПостК, предъявляемое после ТГ, оказывает выраженный нейропротективныйэффект, предотвращая отсроченное развитие апоптотических процессов как вгиппокампе, так и в неокортексе (Рисунок 2).Влияние тяжелой гипоксии и тяжелой гипоксии в сочетании спосткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией на содержаниепротивоапоптотического белка Bcl-2 и нейротрофина BDNF в гиппокампе инеокортексе крыс.