Автореферат (Роль HIF1-зависимой регуляции пентозофосфатного пути в обеспечении реакций мозга на гипоксию), страница 3

С применением ABC иммуногистохимического методаисследовали содержания маркеров нейропротекции, антиапоптотического белка Bcl2 и нейротрофина BDNF, в СА1 поле гиппокампа и втором слое сенсомоторнойкоры крыс. Среднюю оптическую плотность иммунопозитивных к Bcl-2 и BDNFопределяли через 75 и 96 часов после ТГ и, соответственно, через 3 и 24 часа послетретьего сеанса ПостК.10Через 75 часов после ТГ средняя оптическая плотность иммунопозитивных кBcl-2 клеток в СА1 поле гиппокампа крыс достоверно не отличается от контроля,однако через 96 часов после реоксигенации количество этого белка уменьшается до20% от контроля (Рисунок 3, А). Предъявление трех сеансов гипоксического ПостКпосле ТГ сопровождается увеличением средней оптической плотностииммунопозитивных к Bcl-2 клеток в три раза по сравнению с контролем наисследуемых временных точках (Рисунок 3, А).ТГ не приводит к изменению средней оптической плотностииммунопозитивных к BDNF клеток в СА1 поле гиппокампа ни через 75, ни через 96часов после воздействия (Рисунок 3, Б).

В то же время у ПостК животных выявленаup-регуляция содержания BDNF в гиппокампе (Рисунок 3, Б), достигающегопятикратного увеличения относительно базального уровня.Рисунок 3. Средняя оптическая плотность иммунопозитивных к Bcl-2 (A) и BDNF (Б) клеток вСА1 поле гиппокампа контрольных крыс (белые столбики), через 75 и 96 часов после тяжелойгипобарическойгипоксииунепосткондиционированных(черныестолбики)ипосткондиционированных животных (серые столбики). По оси абсцисс - время после тяжелойгипоксии; по оси ординат – средняя оптическая плотность иммунопозитивных клеток в % отконтроля. *, различия с контролем статистически достоверны, р≤0.05; #, различия статистическидостоверны по сравнению с ТГ, р≤0.05.На Рисунке 4 представлены репрезентативные микрофотографиииммунопозитивных к Bcl-2 (Рисунок 4, А-В) и BDNF (Рисунок 4, Г-Е) клеток вовтором слое сенсомоторной коры контрольных крыс и крыс, подвергавшихсявоздействию ТГ или ТГ в сочетании с трехкратным ПостК.

Результатыстатистической обработки микрофотографий данной структуры мозга показывают,что через 4 дня после ТГ наблюдается увеличение средней оптической плотностииммунопозитивных к Bcl-2 клеток до 376% относительно контроля, в то время как уПостК животных происходит снижение этого показателя относительно ТГ, однакоон остается выше контрольных значений (233% от контроля).На четвертый день после воздействия ТГ также наблюдается увеличениеколичества BDNF во втором слое неокортекса (Рисунок 4, Д).

В то же время УГГ врежиме ПостК приводит к дальнейшему увеличению содержания этого белка.11Рисунок 4. Микрофотографии (40х) второго слоя неокортекса контрольных крыс (Контроль)(А,Г), через 4 дня после тяжелой гипоксии (ТГ+4дня) (Б,Д) и через день после тяжелой гипоксии всочетании с трехкратным посткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией(ТГ+3ПостК+1день) (В,Е). Иммуногистохимическая реакция на Bcl-2 (А,Б,В) и BDNF (Г,Д,Е).Маркер, 100 мкм.Влияние тяжелой гипоксии и тяжелой гипоксии в сочетании спосткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией на содержаниеHIF1a и Г6ФДГ в СА1 поле гиппокампа и втором слое сенсомоторной корыкрыс. С применением ABC иммуногистохимического метода для определениясодержания регуляторной альфа субъединицы HIF1 в СА1 поле гиппокампа(Рисунок 5, А) нами была показана up-регуляция этого белка через 1 день послереоксигенации, сопровождающаяся дальнейшим уменьшением средней оптическойплотности иммунопозитивных к HIF1a клеток относительно контроля.

В случаепредъявления ТГ в сочетании с сеансами ПостК УГГ динамика HIF1a в гиппокампесущественно изменяется (Рисунок 5, А), а именно происходит нормализация уровняэтого транскрипционного фактора через 2 дня и сверх-экспрессия через 4 дня послеТГ.В неокортексе крыс, переживших ТГ, выявлена противоположная динамикасодержания HIF1a по сравнению с гиппокампом (Рисунок 5, Б): через 1 день послереоксигенации происходит уменьшение средней оптической плотностииммунопозитивных к этому белку клеток, после чего содержание HIF1a постепенновосстанавливается до контрольных значений.

ПостК не оказывает влияния наиндуцированную ТГ динамику HIF1a во втором слое неокортекса.12Рисунок 5. Микрофотографии (40х). Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии всочетании с гипоксическим посткондиционированием (ТГ+ПостК) на количество HIF1a в CA1поле гиппокампа (А) и втором слое неокортекса (Б) через 1,2 и 4 дня после ТГ. Маркер, 100мкмПри исследовании содержания скорость-лимитирующего фермента ПФП,Г6ФДГ, в СА1 поле гиппокампа (Рисунок 6, А), нами выявлено отсроченноеуменьшение средней оптической плотности иммунопозитивных к этому ферментуклеток через 4 дня после ТГ по сравнению с контролем.

При этом в неокортексепроисходит уменьшение количества Г6ФДГ ко второму дню после ТГ, после чегосодержание исследуемого белка восстанавливается до контрольного уровня(Рисунок 6, Б).13ПостК предотвращает отсроченное снижение количества Г6ФДГ в СА1 полегиппокампа (Рисунок 6, А), не влияя на динамику этого белка в неокортексе(Рисунок 6, Б).Рисунок 6. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с гипоксическимпосткондиционированием (ТГ+ПостК) на среднюю оптическую плотность иммунопозитивных кГ6ФДГ клеток в CA1 поле гиппокампа (А) и втором слое неокортекса (Б) через 1,2 и 4 дня послеТГ.

*, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #, Различия достоверны поотношению к ТГ, p≤0.05.Влияние тяжелой гипоксии и тяжелой гипоксии в сочетании спосткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией на активностьГ6ФДГ и количество НАДФН в гиппокампе и неокортексе крыс. Для оценкифункционального состояния пентозофосфатного пути в гиппокампе и неокортексекрыс, переживших ТГ или ТГ в сочетании с ПостК, нами было произведеноизмерение активности Г6ФДГ и количества восстановленного НАДФ.

Как видно изРисунка 7, А, через 1 день после ТГ активность Г6ФДГ в гиппокампе возрастает до135% от контроля. Однако в дальнейшем происходит снижение активности этогофермента - до 65% через 4 дня после тяжелого гипоксического воздействия.Параллельно этому наблюдается устойчивое уменьшение количества продуктаПФП, НАДФН (Рисунок 7, Б).Рисунок 7. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с гипоксическимпосткондиционированием (ТГ+ПостК) на активность Г6ФДГ (А) и количество НАДФН (Б) вгиппокампе крыс.

Активность Г6ФДГ и количество НАДФН нормализовано на количество общегобелка и выражено в % от контроля. *, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #,Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.14Трехкратное ПостК предотвращает отсроченное снижение активности Г6ФДГв гиппокампе (Рисунок 7, А), что сопровождается постепенной нормализациейколичества НАДФН (Рисунок 7, Б).В неокортексе крыс, переживших ТГ, через 1 и 4 дня реоксигенации невыявлено достоверных изменений активности Г6ФДГ по сравнению с контролем,однако через 2 дня после ТГ наблюдается небольшое уменьшение активностиГ6ФДГ. Количество НАДФН в данной структуре мозга крыс снижено в течениедвух дней после реоксигенации.ПостК предотвращает снижение активности Г6ФДГ, нормализуя количествоНАДФН уже через 2 дня после ТГ.Влияние тяжелой гипоксии и тяжелой гипоксии в сочетании спосткондиционированиемумереннойгипобарическойгипоксиейнаокислительно-восстановительный статус, количество общего глутатиона иинтенсивность процессов перекисного окисления липидов в гиппокампе инеокортексе крыс.

Для оценки наличия окислительного стресса нами был измеренокислительно-восстановительный статус цитозольной фракции гиппокампа инеокортекса крыс по соотношению тиоловых групп к общему содержанию белка.Как видно из Рисунка 8, А, снижение эффективности пентозофосфатного пути вгиппокампе крыс, переживших ТГ, сопровождается долгосрочным смещениемокислительно-восстановительного статуса клеток в сторону закисления. Устойчивоеуменьшение количества глутатиона (Рисунок 8, Б) также указывает на развитиесостояния окислительного стресса в этой структуре мозга крыс в результате ТГ ипоследующей реоксигенации.ПостК нормализует количество тиоловых групп в гиппокампе (Рисунок 8, А),вызывая существенное, хоть и не достигающее контрольных значений, увеличениеколичества глутатиона через 4 дня после ТГ (Рисунок 8, Б).Рисунок 8.

Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с гипоксическимпосткондиционированием (ТГ+ПостК) на количество тиоловых групп (А) и глутатиона (Б) вгиппокампе крыс. Количество тиоловых групп и глутатиона нормализовано на количество общегобелка и выражено в % от контроля. *, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #,Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.15Маркеры окислительного стресса в неокортексе крыс, переживших ТГ,выявлены только через 1 день реоксигенации. В дальнейшем эти показателидостоверно не отличаются от контрольного уровня.ПостК не вызывает достоверного изменения количества тиоловых групп внеокортексе по сравнению с непосткондиционированной ТГ, однако приводит кнебольшому уменьшению количества глутатиона через 4 дня после ТГ.При анализе эффектов ТГ на процессы свободнорадикального окисления вранний период реоксигенации, когда забор материала осуществляли сразу послесеанса ТГ, показано, что ТГ оказывает различный эффект на гиппокамп исенсомоторную кору.