Автореферат (Роль HIF1-зависимой регуляции пентозофосфатного пути в обеспечении реакций мозга на гипоксию), страница 4

Так в гиппокампе наблюдается интенсификация процессовперекисного окисления липидов (ПОЛ) (Рисунок 9), в то время как в неокортекседостоверных изменений процессов ПОЛ не выявлено.Рисунок 9. Влияние тяжелой гипоксии на количество диеновых и триеновых коньюгатов,коэффициент Клейна и количество основыний Шиффа в гиппокампе крыс. Количество продуктовперекисного окисления липидов нормализовано на количество общего фосфора фосфолипидов ивыражено в % от контроля.

* Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05.В дальнейшем в гиппокампе крыс, переживших ТГ, на протяжении 4 днейпосле воздействия не выявлено достоверных отличий количества оснований Шиффапо сравнению с контролем, однако через 1 день после третьего сеанса ПостК этотпоказатель составляет всего 30% от контроля, что указывает на антиоксидантныйэффект ПостК на эту структуру мозга и согласуется с данными о мобилизации ПФП.В неокортексе крыс в течение 4 дней после ТГ количество оснований Шиффадостоверно ниже, чем в контроле.

Через 3 дня после ТГ, а также на всехисследуемых сроках ТГ в сочетании с ПостК достоверных отличий количестваоснований Шиффа по сравнению с контролем для этой структуры мозга невыявлено.16Влияние инъекции ингибитора HIF1 на апоптотические процессы в СА1поле гиппокампа крыс, переживших тяжелую гипоксию. Ингибированиетрансляции HIF1 топотеканом позволило нам изучить участие данноготранскрипционного фактора в развитии индуцируемых тяжелой гипоксиейпроцессов в гиппокампе крыс. Как оказалось, введение ингибитора HIF1 передсеансом повреждающей гипоксии приводит к существенному уменьшениюколичества апоптотических клеток в СА1 поле гиппокампа по сравнению с ТГ(Рисунок 10).Рисунок 10.

Микрофотографии (40х). Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии всочетании с ингибированием HIF1 (ТГ+HIFi) на количество TUNEL-позитивных клеток через 4дня после реоксигенации в СА1 поле гиппокампа крыс. Маркер, 100 мкм.Влияние инъекции ингибитора HIF1 на содержание HIF1a, эритропоэтинаи Г6ФДГ в СА1 поле гиппокампа крыс, переживших тяжелую гипоксию.

Спомощью ABC иммуногистохимического метода анализа содержания HIF1а в СА1поле гиппокампа (Рисунок 11, А) нами было показано, что через 1 день после ТГпроисходит увеличение средней оптической плотности иммунопозитивных к HIF1аклеток до 180% от контроля, после чего средняя оптическая плотностьиммунопозитивных клеток снижается. В случае введения ингибитора HIF1 крысамперед сеансом ТГ через 1 день после начала реоксигенации up-регуляция HIF1a ненаблюдается (Рисунок 11, А), что можно было ожидать, исходя из сведений омеханизмедействиятопотекана,блокирующеготрансляциюэтоготранскрипционного фактора. В отсроченном периоде после ТГ уровень HIF1a вгиппокампе крыс этой группы не отличается от контроля, однако происходит17уменьшение содержания эритропоэтина (Рисунок 11, Б), представляющего собойбелковый продукт транскрипционной активности HIF1, что указывает наэффективность используемого ингибитора.Рисунок 11.

Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с ингибированиемHIF1 (ТГ+HIF1i) на среднюю оптическую плотность иммунопозитивных к HIF1a (А) иэритропоэтину (Б) клеток в CA1 поле гиппокампа через 1,2 и 4 дня после ТГ.

*, Различиядостоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #, Различия достоверны по отношению к ТГ,p≤0.05.При исследовании содержания скорость-лимитирующего ферментапентозофосфатного пути, Г6ФДГ (Рисунок 12), в СА1 поле гиппокампа нами былообнаружено, что ТГ вызывает уменьшение содержания этого фермента через 4 дняпосле реоксигенации по сравнению с контролем. В свою очередь ингибированиеHIF1 перед ТГ предотвращает ослабление экспрессии Г6ФДГ в гиппокампе.Рисунок 12. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с ингибированиемHIF1 (ТГ+HIF1i) на среднюю оптическую плотность иммунопозитивных к Г6ФДГ клеток в CA1поле гиппокампа через 1,2 и 4 дня после ТГ. *, Различия достоверны по отношению к контролю,p≤0.05; #, Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.Влияние инъекции ингибитора HIF1 на активность Г6ФДГ и количествоНАДФН в гиппокампе крыс, переживших тяжелую гипоксию.

Для оценкифункционального состояния пентозофосфатного пути в гиппокампе крыс,переживших ТГ, следующую за инъекцией ингибитора HIF1 или без нее, мы18определили активность Г6ФДГ и измерили количество восстановленного НАДФ.Как показано на Рисунке 13, А, через 1 день после ТГ активность Г6ФДГ возрастаетдо 135% от контроля. Однако в дальнейшем происходит снижение активности этогофермента до 65% через 4 дня реоксигенации. Параллельно этому наблюдаетсяустойчивое уменьшение количества продукта пентозофосфатного пути, НАДФН(Рисунок 13, Б).Ингибирование HIF1 через 1 день после ТГ вызывает снижение, а затемпостепенную нормализацию активности Г6ФДГ до контрольных значений (Рисунок13, А), при этом способствуя увеличению количества НАДФН в гиппокампе крыс(Рисунок 13, Б).Рисунок 13.

Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с ингибированиемHIF1 (ТГ+HIF1i) на активность Г6ФДГ (А) и количество НАДФН (Б) в гиппокампе крыс.Активность Г6ФДГ и количество НАДФН нормализовано на количество общего белка и выраженов % от контроля. *, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #, Различиядостоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.Влияние инъекции ингибитора HIF1 на окислительно-восстановительныйстатус, количество общего глутатиона и оснований Шиффа в гиппокампекрыс, переживших тяжелую гипоксию.

Для оценки эффектов ингибированияHIF1 перед ТГ на процессы окислительного стресса нами был оценен окислительновосстановительный статус цитозольной фракции гиппокампа крыс по соотношениютиоловых групп к общему содержанию белка. Как видно из Рисунка 14, A, ТГвызывает долгосрочное смещением окислительно-восстановительного статусаклеток в сторону окисленного состояния. При этом в случае инъекции ингибитораHIF1, способствующей увеличению эффективности ПФП, перед ТГ не выявленодостоверных изменений окислительно-восстановительного статуса цитозольнойфракции гиппокампа по сравнению с контролем (Рисунок 14, А).Количество общего глутатиона в гиппокампе крыс на всех исследованныхвременных точках после ТГ без инъекции ингибитора HIF1 достоверно ниже посравнению с контролем (Рисунок 14, Б).

В то же время инъекция ингибитора HIF1перед ТГ существенно ослабляет снижение уровня глутатиона (Рисунок 14, Б).19Рисунок 14. Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с ингибированиемHIF1 (ТГ+HIF1i) на количество тиоловых групп (А) и количество глутатиона (Б) в гиппокампекрыс. Количество тиоловых групп и глутатиона нормализовано на количество общего белка ивыражено в % от контроля. *, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #,Различия достоверны по отношению к ТГ, p≤0.05.При оценке интенсивности перекисного окисления липидов, мы использовалиоснования Шиффа в качестве возможного маркера. Использование ингибитораHIF1 способствует ослаблению свободнорадикального окисления в течение 2 днейпосле ТГ (Рисунок 15).Рисунок 15.

Влияние тяжелой гипоксии (ТГ) и тяжелой гипоксии в сочетании с ингибированиемHIF1 (ТГ+HIF1i) на количество оснований Шиффа в гиппокампе крыс. Количество основанийШиффа нормализовано на количество общего фосфора фосфолипидов и выражено в % отконтроля *, различия с контролем статистически достоверны, р≤0.05; #, различия статистическидостоверны по сравнению с тяжелой гипоксией, р≤0.05.Использование модели трехкратной умеренной гипобарической гипоксиидля анализа роли HIF1 в регуляции транскрипции мРНК Г6ФДГ. Исследованиевзаимосвязи между активностью HIF1 и транскрипцией Г6ФДГ в гиппокампе мыпровели с использованием метода ПЦР в реальном времени. В качестве HIF1-20позитивной модели использовали режим трехкратной умеренной гипобарическойгипоксии (Samoilov et al., 2015) на фоне инъекции ингибитора HIF1 либо без нее.Как видно на Рисунке 16, количество мРНК Г6ФДГ существенно увеличиваетсячерез 3 часа и 24 часа после последнего сеанса УГГ.

При этом, ведение ингибитораHIF1 непосредственно перед гипоксическими сеансами усиливает этот эффект какчерез 3 часа, так и через 24 часа после последнего гипоксического эпизода.Рисунок 16. Влияние трехкратной умеренной гипобарической гипоксии (3УГГ) и 3УГГ всочетании с ингибированием HIF1 (3УГГ+HIF1i) на уровень мРНК Г6ФДГ в гиппокампе крысчерез 3 и 24 часа после воздействия. Количество мРНК Г6ФДГ нормализовано на количествомРНК актина-бета. *, Различия достоверны по отношению к контролю, p≤0.05; #, Различиядостоверны по отношению к группе 3УГГ, p≤0.05.ЗАКЛЮЧЕНИЕВ ходе выполнения настоящей работы, посвященной расшифровкенейропротективных механизмов гипобарического ПостК, а также оценке вкладаHIF1 в реализацию постгипоксических эффектов, нами было показано, что тяжелаягипобарическая гипоксия (ТГ) аналогично ишемическим моделям приводит ккраткосрочному увеличению содержания HIF1a, в дальнейшем вызывая уменьшениеего количества.

Также в результате гистохимического исследования апоптотическихклеток и электрофоретического анализа фрагментации ДНК нами подтвержденыранее полученные в нашей лаборатории данные о ТГ-зависимой индукции апоптоза(Rybnikova et al., 2006, 2012). При этом как инъекция ингибитора HIF1 перед ТГ, таки применение ПостК предотвращают развитие апоптотических процессов.Важнейшим элементом метаболизма мозга, вовлеченным в поддержаниеантиоксидантныхсистемиобеспечениенормальногоокислительновосстановительного статуса за счет генерации восстановленного НАДФ, признанпентозофосфатный путь (ПФП) метаболизма глюкозы (Fernandez-Fernandez et al.,2012, Ben-Yoseph et al., 1996). В частности, недавно была показана существеннаярольПФП впредотвращении последствийокислительногостресса,индуцированного депривацией кислорода и глюкозы in vitro (Sun S., et al.