Диссертация (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 19

Трансгенные растения были инокулированы R.leguminosarum bv.viciae CIAM 1026. Образование клубеньков проверяли на 28 дпи (A, B, D,E). Шкалы: (A,B,D,E) 2 мм; (C, F) 1 мм.После инокуляции растений R. leguminosarum bv. viciae CIAM 1026 формированиеклубеньков наблюдали на трансгенных корнях мутантов гороха K24 и RisNod4,содержащих генетическую конструкцию pB7WG2D::Sym37 (Рисунок 14). Всего нами былопроанализировано 22 трансгенных корня у мутанта K24 (pB7WG2D::Sym37), при этом быловыявлено в среднем 9,92 ± 2,16 клубенька на корень. Для линии RisNod4 былопроанализировано 20 трансгенных корней (pB7WG2D::Sym37), при этом было выявлено9,72 ± 1,55 клубенька на корень (P<0.05). Эксперименты были проведены в двухнезависимых биологических проворностях.У растений K24 (было проанализировано 27 трансгенных корней) и RisNod4 (23трансгенных корня), трансформированных pB7WG2D::GUS, образования клубеньков ненаблюдали. (23 трансгенных корня), трансформированных (9,54 ± 1,71 клубеньков накорень).Однако при трансформации мутантов K24 и RisNod4 по гену sym37 генетическойконструкцией pB7WG2D::K1, нами были найдены клубеньки на трансгенных корнях такихрастений.

У линии K24 был проанализирован 21 корень у растений, трансформированных85pB7WG2D:K1, на них было выявлено в среднем 9,73 ± 2,05 клубенька на корень (P <0.05).УлинииRisNod4былопроанализировано25корней,трансформированныхpB7WG2D:GUS(образование клубеньков не наблюдали), 23 корня, трансформированныхpB7WG2D:K1 (9,54 ± 1,71 клубеньков на корень), и 20 корней, трансформированныхpB7WG2D:Sym37 (9,72 ± 1,55 клубеньков на корень) (P<0.05).Таким образом, при трансформации растений, дефектных по гену sym37,полноразмерной кодирующей последовательностью гена K1, происходило восстановлениеих способности формировать клубеньки. Эти данные, на наш взгляд, можно объяснить тем,что К1 не только участвует в инициации развития симбиоза у гороха (в составе комплексас Sym10), но и контролирует более поздние этапы этого процесса, связанные с развитиеминфекции и эндоцитозом бактерий в клетки растений.

Можно предположить, что в этомслучае рецептор К1 работает дополнительно на этапе уже после активации рецепторногокомплекса Sym10/Sym37, поэтому способен восстанавливать функцию Sym37. Отсутствиевосстановления этой функции у мутантов по гену sym37invivo, в таком случае может бытьсвязано с тем, что работа рецепторов Sym10/К1 и Sym10/Sym37 может способствоватьвыработке сигнала, который необходим для активации событий, определяющих эндоцитозбактерий с участием рецептора К1.В пользу этого предположения свидетельствуютданные по изучению мутантной линии 817 по гену k1 у гороха.Таким образом, в результате проведенных исследований нами было полученоэкспериментальное подтверждение гипотезы о возможности участия двух типоврецепторов в контроле развития симбиоза у гороха, работающих на разных стадиях этогопроцесса. На основании полученных результатов может быть предложена модель работыне отдельных рецепторов, а олигомерных рецепторных комплексов Sym10/К1 иSym10/Sym37, контролирующих развитие симбиоза.

При этом комплекс Sym10/К1необходим для инициации симбиоза. Рецепторы Sym10/Sym37 могут участвовать врегуляции развития инфекционного процесса у гороха (инициации роста инфекционныхнитей). Следует отметить, что ранее способность контролировать развитие инфекции,зависимым от структуры Nod-факторов образом, была показана для линий горохаафганского и европейского происхождения, несущих разные аллели гена sym2(sym2A иsym2E). В таком случае, в составе олигомерного рецепторного комплекса Sym10 и Sym37может быть еще дополнительный рецептор Sym2 (Sym10/Sym37/Sym2), контролирующийразвитие инфекционного процесса (Рисунок 15).86С активацией этих комплексов у гороха может быть связано появлениедополнительного сигнала, который необходим для эндоцитоза бактерий из инфекционныхнитей, в контроле которого вновь принимает участие рецептор К1.Рисунок 15. Схема организации работы рецепторных комплексов при узнаванииNod-факторов у гороха.87Заключение.При бобово-ризобиальном симбиозе обмен сигналами между партнерами запускаеткомплекс реакций, которые приводят к развитию новых органов на корнях растений –азотфиксирующих клубеньков.

Ключевыми регуляторами этого процесса являютсявыделяемые ризобиями сигнальные молекулы Nod-факторы. Биологическая активностьэтих молекул проявляется при низких концентрациях, а химическая структура определяетспецифичность взаимодействия между партнерами. Эти особенности влияния Nodфакторов указывают на то, что у бобовых растений в узнавание этих сигнальных молекулвовлеченыспецифичныерецепторы.Анализмутантовбобовыхрастений,невосприимчивых к действию Nod-факторов, показал, что в рецепцию этих сигнальныхмолекул могут быть вовлечены рецептор-подобные киназы с LysM-мотивами вовнеклеточном домене (LysM-РПК).

Впервые два рецептора этого типа были открыты убобового растения лядвенца L. japonicus, формирующего детерминированные клубеньки.Было показано, что один из рецепторов LjNFR5 имеет неактивный киназный домен и вкомплексе с LysM-РПК LjNFR1 необходим для инициации развития симбиоза. Несмотря нато, что гомологи генов, кодирующих LjNFR5 и LjNFR1, были найдены у бобовых растений(люцерны, гороха), формирующих клубеньки недетерминированного типа, до настоящеговремени механизмы активации рецепторов при связывании Nod-факторов у них остаютсядалекими от понимания. Это определило наш интерес к выяснению того, как организованыи функционируют у данного типа бобовых растений рецепторы к Nod-факторам.Ранее анализ ответных реакций растений на инокуляцию бактериальнымимутантами, выделяющими Nod-факторы с измененной структурой, позволил предложитьгипотезу о том, что в рецепцию этих сигнальных молекул у люцерны и гороха,формирующих клубеньки недетерменированного типа,вовлечены два разных поспецифичности рецептора.

Один, работающий на самых ранних этапах развития симбиоза,менее специфичен по отношению к структуре Nod-фактора, а другой контролирует процессинфицирования и более строго специфичен по отношению к структуре этих молекул. Угороха P. sativum L. были выявлены два возможных кандидата на роль рецепторов к Nodфакторам - LysM-РПК Sym10 и Sym37. Анализ мутантов по генам sym10 и sym37соответствует этому представлению: у мутанта по гену sym10 блокируются все ответныереакции на действие Nod-факторов, а у мутанта по гену sym37- развитие инфекционногопроцесса, тогда как самые ранние реакции на действие Nod-фактора развиваются.

Однако88у рецептора Sym10 киназный домен является неактивным, что указывает на возможностьего работы в гетеромерном комплексе с другим рецептором с активным киназным доменом.При скрининге библиотеки кДНК инокулированных корней гороха был выделен генК1, гомолог гена Sym37. На основании данных о том, что ген К1 был обнаружен вбиблиотеке кДНК корней гороха на ранних стадиях после инокуляции, а такжеособенностей строения киназного домена, в котором присутствовали аминокислоты YAQ вактивационной петле, что характерно для симбиотических рецепторов, нами быловыдвинуто предположение о возможном участии К1 в контроле развития симбиоза.

Этоопределило необходимость изучения роли LysM-РПК К1 гороха в развитии симбиоза сризобиальными бактериями, а также структурной организации рецепторов гороха имеханизмов их активации при распознавании ризобиальных сигналов Nod-факторов.На первом этапе исследований нами был проанализирован уровень экспрессиигенов, кодирующих симбиотические LysM-РПК гороха на разных этапах развитиясимбиоза. Анализ данных, полученных с помощью количественной (кОТ-ПЦР), показалактивацию гена K1 на ранних этапах развития симбиоза. Небольшое увеличение экспрессиягена K1 происходило и в клубеньках по сравнению с контрольными неинокулированнымикорнями.

Сходным образом два других гена Sym10 и Sym37, кодирующие LysM-РПК,показали повышенный уровень экспрессии на начальных этапах формирования симбиоза ивпроцессеразвитияклубеньков.Следовательно,активациягенаК1можетсвидетельствовать о его вовлечении в контроль как ранних, так и более позних этаповразвития симбиоза.Поиск с помощью TILLING подхода позволил получить и провести генотипическийи фенотипический анализ мутантных линий по гену k1 (817, 885 и 2265). У двух мутантныхлиний был выявлен Nod- - фенотип, при этом развитие симбиоза было нарушено на самыхранних этапах развития симбиоза.

У растений мутантной линии 885, несущей мутацию вактивационной петле киназного домена, наблюдали практически полное отсутствиереакций на инокуляцию ризобиями. Однако с очень редкой частотой у таких растенийформировались короткие абортивные инфекционные нити, связанные только с маленькимискрученными волосками. У растений гороха линии 817, несущей миссенс-мутацию вучастке гена, кодирующем LysM3 мотив внеклеточного домена, было выявленосущественное нарушение развития инфекционных нитей – они имели sac-подобнуюструктуру и при этом выхода бактерий из инфекционных нитей не наблюдалось. При этоманализ экспрессии генов, контролирующих развитие защитных реакций у растений, спомощью кОТ-ПЦР показал, что К1 может являться регулятором пути, который блокируетразвитие таких реакций при формировании симбиоза.89Среди трех изученных мутантов, только у линии 2265, имеющей заменуаминокислоты в LysM1 мотиве внеклеточного домена LysM-РПК К1, формировалиськлубеньки.