Диссертация (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 16

Так, линия гороха SGEFix–-2 несет мутацию в гене sym33, кодирующемтранскрипционныйфакторPsIPD3/PsCYCLOPS,испособнаформироватьнемногочисленные белые клубеньки. Процесс выхода бактерий из инфекционных нитей уданного мутанта нарушен – бактерии остаются «запертыми» внутри инфекционных нитей,окруженных толстой растительной клеточной стенкой (Tsyganov et al., 1998; Voroshilova etal., 2001).

Ген Sym33 является ортологом гена IPD3 M. truncatula (Ovchinnikova et al., 2011).Линия гороха SGEFix-1 несет мутацию в гене sym40, формирует белые клубеньки сгипертрофированными инфекционными нитями и каплями, характеризуется нарушениемдифференцировки бактероидов и ранним старением клубеньков (Tsyganov et al., 1998;Voroshilova et al., 2009). Ген Sym40 – ортолог гена EFD M. truncatula - возможный69негативный регулятор цитокининового ответа (Неманкин, 2011).

Гистологический анализнеэффективных клубеньков у этих мутантов позволил выявить откладывание каллозы исуберина в инфекционных нитях, накопление неэстерифицированного пектина в клеточныхстенках инфекционных нитях (Ivanova et al., 2015), что свидетельствует об активациизащитных реакций. Кроме того, у данных мутантов наблюдалось увеличение уровняэкспрессиигенов,кодирующихпероксидазу,маркергиперчувствительнойреакции и белок PR10. Был выдвинуто предположение, что мутации в данных генах ведутк тому, что растение распознает ризобию не как партнера-симбионта, а как патоген,вследствие чего у растений включаются защитные механизмы, препятствующийпроникновениюризобийвнутрь.Схожийфенотипмутантнойлинии817,характеризующейся развитием гипертрофированных sac-подобных нитей, откуда непроисходит выход бактерий, позволяет предположить, что у данного мутанта такжепроисходит развитие защитных реакций при попытке проникновения ризобий.Активация защитных реакций на ранних стадиях формирования симбиоза былавыявлена при анализе транскриптомов корней модельных бобовых растений, обработанныхNod-факторами или ризобиями.

Было показано быстрое увеличение уровня экспрессиизащитных генов (через 1 час в случае M. truncatula и 12 часов для L. japonicus). Так, приобработке растений L. japonicus очищенными Nod-факторами наблюдали экспрессию рядагенов, связанных с защитными реакциями – PR-гены (от англ. pathogenesis-related –связанные с патогенезом), гены кодирующие ферменты – пероксидазу и хитиназу, гены,кодирующие транскрипционные факторы ERF (от англ. ethylene response factors отвечающий на этилен фактор транскрипции) и WRKY (Kouchi et al., 2004). Однако, вотличие от развития таких реакций при взаимодействии с патогенами, экспрессиязащитных генов при симбиозе возвращалась на «базовый» уровень уже через 48 часов,возможно из-за активного подавления развития защитных реакций (как со стороныризобий, так и со стороны растения). Синтез белков, участвующих в защитных реакциях,можно было также наблюдать в протеомах корней различных бобовых (Marx et al., 2016,Леппянен и др., 2017).Для изучения влияния рецептор-подобной киназы К1 на развитие защитных реакцийпри формировании симбиоза мы провели анализ уровня экспрессии генов - PR1 и PR10 урастений мутантов 817 линии, характеризующихся блокированием выхода бактерий изинфекционных нитей (Рисунок 4.

II) с помощью количественной ОТ-ПЦР (Рисунок 7).70Рисунок 7. Анализ экспрессии генов PR1, PR10 – маркеров развития защитныхреакций при инокуляции гороха исходного сорта Cameor (WT) и мутантной линии 817по гену к1 в корнях и клубеньках с помощью количественной ОТ-ПЦР на 1, 2 и 5 деньпосле инокуляции ризобиями.Анализ показал небольшое увеличение уровня экспрессии генов PR1 и PR10 в корняхрастений дикого типа в ответ на инокуляцию на 1 и 2 сутки, что соответствуетлитературным данным для других бобовых растений (Chen et al., 2017; Serna-Sanz et al.,2011). Однако при этом растения мутантной линии 817 характеризовались большимувеличением уровня экспрессии этих генов. Это может говорить о том, что из-за мутации вгене к1 данные растения воспринимают ризобию как патоген, а значит К1 возможно можетрегулировать запуск каскада защитных реакций при формировании симбиоза.Изучение более поздних этапов ризобиального симбиоза также показало наличиереакций, сходных с реакциями при патогенной атаке.

Так при развитии инфекционной нитив ее матриксе происходит накопление тех же гликопротеинов, что и при развитиипатогенеза. При этом освобождение перекиси водорода может способствовать сшивке71гликопротеинов, что ведет к невозможности проникновения микроорганизмов, в том числеи ризобий, внутрь клетки растения (Brewin et al., 2004).Недавно у M.

truncatula были выявлены два гена, необходимых для подавлениязащитных реакций в ходе развития инфекционных нитей, выходе бактерий из них иформирования симбиосом - DNF2 (от англ. Does Not fix nitrogen - не фиксирующий азот)и SymCRK (от англ. symbiotic cysteine-rich receptor-like kinase – симбиотическая цистеинбогатая рецптор-подобная киназа). Эти гены кодируют фосфатидилинозитол специфичнуюфосфолипазу С и цистеин-богатую рецептор-подобную киназу соответственно. Мутанты,дефектные по этим генам, хоть и образуют клубеньки, однако они характеризуютсянарушениями в дифференцировке бактероидов, экспрессией генов, связанных с защитнымиреакциями, и ранним старением (Bourcy et al., 2013; Berrabah et al., 2014).

Анализ выявил,что оба этих гена независимо друг от друга контролируют блокировку развития защитныхреакций при клубенькообразовании (Berrabah et al., 2014).Для изучения влияния рецептор-подобной киназы К1 на развитие защитных реакцийпри формировании симбиоза мы также провели анализ уровня экспрессии генов - DNF2 иSymCRK у растений дикого типа и мутантной линии 817, с помощью количественной ОТПЦР (Рисунок 8). Анализ не выявил достоверных различий в уровне экспрессии этих геновна ранних сроках после инокуляции (данные не представлены), однако на 14 дпи вклубеньках растений дикого типа наблюдали значительное увеличение экспрессии DNF2 иSymCRK (Рисунок 8).

Напротив, в корнях растений мутантной линии 817 (не формирующейклубеньков) изменений в экспрессии DNF2 и SymCRK не наблюдали.72Рисунок 8. Анализ экспрессии DNF2, SymCRK генов – маркеров блокировки развитиязащитных реакций при формировании симбиоза при инокуляции гороха исходногосорта Cameor (WT) и мутантной линии 817 по гену к1 в корнях и клубеньках спомощью количественной ОТ-ПЦР на 9 и 14 день после инокуляции ризобиями.Полученные данные по изучению экспрессии двух этих генов у мутантной линии817 позволяют предположить, что LysMР-РПК К1 в процессе развития симбиоза можетактивировать сигнальный путь, который подавляет развитие защитных реакций со сторонырастений. У мутанта такого блокирования не происходит, вследствие чего растениевоспринимает ризобии как патоген, что препятствует их проникновению.Таким образом, впервые для бобовых была показана роль LysMР-РПК К1 в контролевыхода ризобий из инфекционной нити.

Были получены первые доказательства того, чтотакой контроль может осуществляться посредством регуляции развития защитных реакцийсо стороны растений, а, следовательно, К1 может являться регулятором путей развитиязащитных реакций при формировании симбиоза.733.3. Анализ взаимодействия LysM-рецептор-подобных киназ K1, Sym10 иSym37 гороха в различных гетерологичных системах.Формированиеолигомерныхкомплексовявляетсянеобходимымусловиемактивации трансмембранных рецепторных киназ при узнавании лиганда, что определяетпоследующую передачу сигнала в клетку (Hubbard, 2004; Pawson, 2004).

Можнопредположить, что такой же механизм активации характерен и для выявленных нами LysMРПК гороха при узнавании лиганда - Nod-фактора.Для изучения возможности формирования комплексов между LysM-РПК Sym10, K1и Sym37 гороха были использованы два подхода – трансформация листьев N. benthamianaдля временного синтеза белков и анализ взаимодействия белков с помощью дрожжевойдвугибридной системы.3.3.1.

Трансформация листьев N. benthamiana с помощью A. tumefaciens длявременного синтеза белка.(Получение генетических конструкций для синтеза белков К1 и Sym10 выполненодиссертантом самостоятельно. Эксперименты по трансформации листьев N. benthamianaбыли проведены под руководством внс Долгих Е.А.)Трансформацию листьев N. benthamiana используют для временного синтеза белков(в течение 24 – 96 часов) в гетерологичной системе, обычно под контролем промотораCaMV35S. Синтез в листьях N.