Диссертация (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 18

Анализ взаимодействия белков с помощью дрожжевой двугибриднойсистемы (по Stynen et al ., 2012).Все изучаемые LysM-РПК гороха имеют трансмембранные домены и сигнальныепептиды, которые могут быть узнаны дрожжевой транспортной системой. Для того, что быбыть полностью уверенными в том, что изучаемые белки синтезируются в ядрах дрожжейи не переносятся в мембрану клеток, мы проанализировали взаимодействие только длявнеклеточных доменов (ECD) Sym10, K1 и Sym37 (без сигнальных пептидов итрансмембранных доменов) (Рисунок 11). Внеклеточный домен AtCERK1 арабидопсисабыл использован в качестве контроля, поскольку представляет собой рецептор, который неучаствует в развитии симбиоза у данного растения.79Рисунок 12. Анализ взаимодействия внеклеточных доменов LysM-РПК K1, Sym37 иSym10 гороха с помощью дрожжевой двугибридной системы.

После трансформациидрожжей штамма S. cerevisiae Mav203 конструкциями для синтеза белков, анализироваливозможность их роста на селективной среде SD -Leu-Trp+His+Ura (проверка на наличиедвух векторов в клетках дрожжей). Рост на селективной среде SD -Leu-Trp-His-Ura и SD Leu-Trp-His-Ura в присутствии 50 мM 3AT (3-амино-1,2,4-триазол) указывает на наличиевзаимодействия.

В качестве контроля для оценки силы взаимодействия были использованывекторы, предложенные производителем (Invitrogen, США).Мы показали, что внеклеточный домен Sym10-ECD, слитый с активационнымдоменом GAL4, может взаимодействовать с внеклеточным доменом K1-ECD и Sym37-ECD,но не образует комплекса с AtCERK1-ECD. В свою очередь K1-ECD и Sym37-ECD,соединенные с активационным доменом GAL4, были способны взаимодействовать сSym10-ECD (данные не представлены). Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что80между внеклеточными доменами LysM-РПК Sym10 и K1, а также Sym10 и Sym37 могутформироваться гетероолигомерные комплексы.

Это согласуется с данными, полученнымипри совместном синтезе этих рецепторов в листьях N. benthamiana, который приводит кактивации реакции гиперчувствительности.Достаточно неожиданным результатом было выявленное нами взаимодействиемежду Sym37-ECD и рецептором к хитоолигосахаридам арабидопсиса CERK1-ECD(сильная реакция) с помощью дрожжевой двугибридной системы.

При этом между K1-ECDи CERK1-ECD наблюдали только слабую реакцию (Рисунок 12). Это позволяет сделатьвывод о том, что Sym37 может формировать гетроолигомерный комплекс с CERK1подобными белками. Наблюдаемое взаимодействие между внеклеточными доменамиSym37 и CERK1, а также К1 и CERK1, может свидетельствовать о роли Sym37 и K1 нетолько в развитии бобово-ризобиального симбиоза, но и об их возможном участии врегуляции симбиоза с грибами арбускулярной микоризы (АМ) и иммунном ответе растенийпри патогенезе.

В пользу данного предположения о возможной двойной ролисимбиотических рецепторов свидетельствуют данные о необходимости рецептора дляконтроля устойчивости растений к заражению фитопатогенными грибами (Rey et al., 2013).Это предположение подтверждается тем, что, например, ген К1 экспрессируется нетолько в корнях и клубеньках, но и в листьях и стеблях гороха (Zhukov et al., 2008). С другойстороны, показано более интенсивное взаимодействие между Sym37 и AtCERK1, но не K1с AtCERK1. Это позволяет предположить, что белок со сходной с AtCERK1 структурой,может быть необходим для формирования гетеромерного комплекса именно с Sym37.Sym37 имеет высокую гомологию и функциональное сходство с MtLYK3 и LjNFR1.

Обеэти LysM-РПК необходимы не только для развития бобово-ризобиального симбиоза, но инеобходимы для симбиоза с грибами АМ (Zhang et al., 2015). Вероятно, Sym37 и имеющийсходство с CERK1 арабидопсиса рецептор у гороха, могут контролировать развитиеарбускулярной микоризы. Однако это предположение требует дополнительной проверки.С помощью дрожжевой двугибридной системы было также показано, что мутация влинии 2265 не оказывает влияние на взаимодействие внеклеточного домена К1 с Sym10,тогда как мутация в линии 817 напротив приводит к невозможности такого взаимодействия.С помощью дрожжевой двугибридной системы было также показано, что мутация влинии 2265 не оказывает влияние на взаимодействие внеклеточного домена К1 с Sym10,тогда как мутация в линии 817 напротив приводит к невозможности такого взаимодействия.Взаимодействие между LysM-РПК Sym10 и К1, а также Sym10 и Sym37 наблюдали вотсутствии лиганда Nod-фактора, как в дрожжевой двугибридной системе, так и присовместном синтезе в листьях N.

benthamiana. На основании изучения других81трансмембранных рецепторов предложены два возможных активационных механизма ихработы. В первом варианте лиганд, связывается с одним из рецепторов, вызывает изменениеего конформации, что определяет способность взаимодействовать с ко-рецептором.

Вдругом варианте взаимодействие лиганда с несколькими рецепторами стабилизирует этоткомплекс и определяет его способность передавать сигнал внутрь клетки (Schulze et al.,2010).В наших экпериментах был осуществлен синтез LysM-РПК в листьях N. benthamianaпод промотором CaMV35S, который обеспечивает достаточно высокий уровень их синтезав мембране. Вероятно, это может определять взаимодействие рецепторов даже в отсутствиилиганда. Другими словами, это позволяет симулировать ситуацию с формированиемрецепторного комплекса, происходящего invivoпри связывании лиганда.

Однако такоевзаимодействие осуществляется только между комплементарными белками, посколькуреакция гиперчувствительности не наблюдали при совместном синтезе Sym10 и Sym19(LRR-РПК, которая относится к другому классу рецепторов и имеет другое строение).С другой стороны, в дрожжевой двугибридной системе уровень синтеза белков неявляется очень высоким, однако, но мы также наблюдали взаимодействие между Sym10/K1и Sym10/Sym37. Это указывает на то, что «комплементарность» белков друг к другуопределяет их взаимодействие.

Для проверки данного предположения необходимопровести сайт-направленный мутагенез, влияющий на замену аминокислот, которые могутбыть важны для белок/белкового взаимодействия в дополнение к тем, которые важны длясвязывания Nod-фактором.3.4. Сравнительный анализ роли рецепторов К1 и Sym37 у гороха приразвитии симбиоза.3.4.1. Комплементация гена К1 мутантой линии 817 полноразмернойпоследовательностью этого гена исходной линии Cameor.Для анализа возможности мутантов по гену k1 восстанавливать способностьформировать симбиоз, была проведена трансформация растений мутантой линии 817конструкцией, содержащейполноразмерную последовательность гена K1 и Sym37 исходнойлинии Cameor.С этой целью была получена генетическая конструкция в векторе pB7WG2D,содержащем кодирующую последовательность гена K1 или Sym37 (без интронов) исходнойлинии Cameor под промотором 35S.

Трансформацию растений гороха мутантной линии 817по гену к1 осуществляли с помощью штамма A. rhizogenes Arqua 1, несущего векторыpB7WG2D::K1или pB7WG2D::Sym37 (Рисунок 12). В качестве контроля использоваливектор pB7WG2D, в котором ген GUS, кодирующий β-глюкоронидазу, был клонирован под82промотором 35S.Так же в качестве негативного контроля использовали вектор pB7WG2D,в котором последовательность гена К1, несущая мутацию аналогичную мутацию в линии817, был клонирована под промотором 35S.Рисунок 13. Комплементация мутантой линии 817 по гену к1.Для трансформации растений с помощью A.

rhizogenes были использованы конструкцииpB7WG2D::K1 (A) и pB7WG2D::Sym37 (Б), содержащие полноразмерные кодирующиепоследовательности генов К1 и Sym37 исходной линии Cameor. В качестве контроляиспользовали растения, трансформированные конструкцией pB7WG2D::GUS (В) иpB7WG2D (p35S::K1::817), несущую мутантную копию к1, в которой мутациясоответствовала мутации в линии 817. Полученные трансгенные растения гороха былиинокулированы R.

leguminosarum bv. viciae CIAM 1026. Образование клубеньков оценивалина 28 дпи (A). Шкала: 2 мм.После инокуляции растений гороха R. leguminosarum bv. viciae CIAM1026формирование клубеньков наблюдали только на трансгенных корнях, содержащихконструкцию pB7WG2D-К1 (было проанализировано 17 корней). Формированияклубеньков не наблюдали на трансгенных корнях гороха, содержащих конструкциюpB7WG2D::Sym37 (14 трансгенных корней), pB7WG2D::GUS(15 трансгенных корней) иpB7WG2D (p35S::K1::817) (35 трансгенных корней) (Рисунок 13).

На трансгенных корняхгороха линии 817 после трансформации pB7WG2D:K1 было выявлено в среднем 8,52 ± 1,05клубеньков на один корень (P <0.05). Таким образом, восстановление способности83формировать клубеньки в ответ на инокуляцию у мутанта по гену k1 (линия 817) наблюдалитолькоприиспользованиидлятрансформацииполноразмернойкодирующейпоследовательности гена K1 исходной линии Cameor. Это свидетельствует о том, чтофенотип Nod- этой линии определяется только мутацией в гене k1, а не влиянием другихмутаций, полученных с помощью TILLING подхода.Неспособность полноразмерной кодирующей последовательности гена Sym37,имеющего высокий уровень сходства с геном K1, восстанавливать способность кформированию клубеньков, свидетельствует о разной функции кодируемых этими генамирецепторов у гороха при симбиозе.3.4.2.

Коплементация линий K24 и RisNod4, несущих мутацию по гену sym37.Гены Sym37 и K1 имеют высокий уровень сходства - 86% идентичности понуклеотидной последовательности (около 75% по последовательности, кодирующейвнеклеточный домен рецептора, и 95% - по последовательности, кодирующей киназныйдомен (Zhukov et al., 2008). Это позволяет предположить, что K1 и Sym37 могутфункционально замещать друг друга при развитии симбиоза (так называемаявырожденность функций, от англ. redundancy). Однако ген Sym37 (полноразмернаякодирующая последовательность) был не способен функционально замещать K1 у мутанта817.Вместе с тем, мы также проверили способность K1 функционально замещать Sym37 умутантов RisNod4 и K24 (Engvild 1987; Postma et al., 1988; Borisov et al., 2007) по этомугену.

С этой целью была проведена трансформация мутантов RisNod4 и K24 по гену sym37,имеющих Nod- фенотип, полноразмерными кодирующими последовательностями геновSym37 и K1. Трансформацию растений гороха RisNod4 и K24 по гену sym37 осуществлялис помощью штамма A. rhizogenes Arqua 1, несущего векторы pB7WG2D::Sym37 иpB7WG2D::K1 (Рисунок 11). В качестве контроля использовали вектор pB7WG2D, вкотором ген GUS, кодирующий β-глюкоронидазу, был клонирован под промотором 35S.84Рисунок 14. Комплементация мутантов K24 (A, B, C) и RisNod4 (D, E, F) по гену sym37.Были использованы конструкции pB7WG2D:K1 (A, D), pB7WG2D::Sym37 (B, E) иpB7WG2D::GUS (C, F) (контроль).