Диссертация (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 17

benthamiana был первоначально разработан для изучениявзаимодействия изучаемых белков методом FRET (от англ. Förster resonance energy transfer- резонансный перенос энергии флуоресценции) (Madsen et al., 2010). При использованииданного метода последовательности генов, кодирующие изучаемые белки, сливаются водну рамку считывания с последовательностями, кодирующими флуоресцентные белки.При этом используется пара флуоресцирующих белков, у которых свечение одного избелков (донора) в результате поглощения кванта света может одновременно возбуждатьдругой белок (акцептор) при близком взаимном расположении (около 10 нм). В результатетакой передачи энергии акцептор становится способным излучать свет определеннойдлины волны.

По появлению такого свечения акцептора можно сделать вывод о том, чтобелки взаимодействуют.Однако ранее при изучении взаимодействия двух известных LysM-РПК лядвенцаLjNFR5 и LjNFR1 в листьях N. benthamiana было показано, что использование метода FRET74является невозможным, поскольку совместный синтез данных рецепторов приводит кбыстрому развитию реакции гиперчувствительности и некрозу тканей (Madsen et al., 2010;Pietraszewska-Bogieletal.,2013).Однакосамфактразвитияреакциигиперчувствительности является доказательством взаимодействия между белками.Вероятно, у небобового растения N.

benthamiana взаимодействие двух LysM-РПК приводитк активации иммунного ответа, что приводит к некрозу тканей листьев.Для трансформации нами были использованы два различных штамма A. tumefaciensLBA 4404 и GV3101. Инфильтрация агробактерий, содержащих конструкции для синтезасоставных белков (слитых с флуоресцентными белками – желтым (YFP) и красным (RFP),приводила к их появлению в мембранах клеток листьев при моно-трансформации.Локализацию белков в листьях после моно-трансформации анализировали с помощьюконфокальной лазерной микроскопии (Рисунок 8). Все синтезируемые полноразмерныебелки K1-RFP, Sym10-YFP и Sym37-YFP были локализованы в плазматической мембранелистьев, что соответствует представлению о том, что они являются трансмембраннымирецепторами у гороха (Рисунок 8).Рисунок 9.

Синтез К1-RFP, Sym10-YFP и Sym 37-YFP в листьях N. benthamiana сиспользованием конструкций под промотором CaMV 35S.А – локализация полноразмерных белков в плазматических мембранах растительныхклеток. Реакция гиперчувствительности при моно-трансформации не развивалась.Б – Вестерн-блот анализ PsК1, PsSym10 и PsSym 37 белков в листьях N. benthamianaс помощью анти-RFP и анти-YFP антител. Для выявления белков в листьях белки были75разделены с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ, а затем выявлены с помощью антителв хемилюминесцентной реакции.О синтезе белков после трансформации листьев N. benthamiana свидетельствовалирезультаты Вестерн-блот анализа с антителами против RFP и YFP.

Нами были выявленыбелки с ожидаемой молекулярной массой (Рисунок 9) - Sym37-YFP – 106,1 кДа, Sym10-YFP– 103,5 кДа, K1-RFP – 108,2 кДаРисунок 10. Анализ развития реакции гиперчувствительности при временном синтезебелков в листьях N. benthamiana LysM-РПК Sym10, K1 и Sym37. Синтез былосуществлен в результате трансформации листьев штаммами A. tumefaciens. При монотрансформации Sym10-RFPи K1-YFP развитие реакции гиперчувствительности непроисходило. Развитие реакции гиперчувствительности наблюдали при совместномсинтезе Sym10/ K1 и Sym10/ Sym37.

Развитие реакции гиперчувствительности ненаблюдали при совместном синтезе Sym10/ Sym19 (контроль).Синтез изучаемых белков Sym10, K1 и Sym37 при моно-трансформации не вызывалразвития реакции гиперчувствительности (Рисунок 9). Для того, что избежать подавлениясинтеза изучаемых белков при трансформации N. benthamiana дополнительно вносиливектор, необходимый для синтеза P19 (вирусного белка). Р19 препятствует активациизащитных систем растения, подавляющих синтез изучаемых белков. При использованииP19 было показано увеличение уровня синтеза белков Sym10, K1 и Sym37 (Рисунок 9).76На следующем этапе был осуществлен совместный синтез изучаемых белков вразличных комбинациях. Было показано, что совместный синтез белков-рецепторовSym10/K1 и Sym10/Sym37 приводит к развитию реакции гиперчувствительности через 48часов после трансформации (появление «мокнущих» участков в результате разрушенияклеток), что сопровождается некрозом тканей листьев через 5-6 дней (Рисунок 10).В качестве контроля был использован LRR-рецептор Sym19 с активным киназнымдоменом, который участвует в передаче сигнала от Nod-фактора при симбиозе (Schneider etal, 1999; Stracke et al.

2002). Однако совместный синтез Sym10 и Sym19 не вызывал развитиереакции гиперчувствительности (Рисунок 10). Поскольку синтез отдельных белков неприводил к гибели клеток, можно сделать вывод о том, что развитие реакциигиперчувствительности является специфичной реакцией при совместном синтезеизучаемых белков. Было проведено 3 независимых биологических эксперимента (по 10-12растений на каждый вариант). Реакция гиперчувствительности не развивалась при монотрансформации листьев конструкциями для синтеза K1-RFP - 0/42 листьев, Sym10-YFP –0/44 листьев. При ко-трансформации реакция гиперчувствительности развивалась соследующей эффективностью: Sym10-YFP/K1-RFP – 45/46 листьев, Sym10-YFP/Sym37-YFP– 42/44 листьев, Sym10-YFP/Sym19-YFP – 0/48 листьев (контроль).Развитие такой реакции при совместном синтезе свидетельствует о том, что данныерецепторы могут активировать путь передачи сигнала, ведущий к развитию иммунногоответа у небобового растения.

Отсутствие реакции при совместном синтезе Sym10 и LRRрецептора Sym19 (Stracke et al. 2002), показывает специфичность взаимодействия междурецепторами Sym10 и K1.Вместе с тем, мы наблюдали развитие реакции гиперчувствительности присовместном синтезе Sym10 и Sym37, что указывает на то, что Sym10 способенвзаимодействовать с двумя структурно сходными LysM-РПК К1 и Sym37.

У мутантов погену sym37 нарушение развития симбиоза наблюдается на стадии формированияинфекционных нитей, что указывает на участие рецептора Sym37 в контролеинфекционного процесса у гороха (Zhukov et al., 2008). Способность Sym10 формироватькомплекс с Sym37, необходимым для развития инфекции, позволяет предположить, чтоSym10 также может быть вовлечен в контроль развития инфекции.

Непосредственныхдоказательств того, что Sym10 вовлечен в контроль инфекции у гороха нет, однако онибыли получены для рецептора NFP M. truncatula (ген Sym10 является ортологом MtNFP).Известно, что мутант nfp, также, как и мутант по гену sym10, характеризуется полнымблокированием развития симбиоза. Однако эксперименты с трансгенными растениями, укоторых экспрессия гена MtNFP была подавлена с помощью РНК-интерференции,77показали, что рецептор NFP необходим для контроля развития инфекционного процесса,поскольку у трансгенных растений, не формирующих клубеньков (Nod- фенотип)формировались абортивные sac-подобные инфекционные нити (Arrighi et al., 2006).Сходным образом эксперименты по замене LysM1, LysM2 и LysM3 мотивов у рецептораNFP на аналогичные мотивы рецептора Sym10 показали, что NFP у M. truncatula необходимдля развития инфекционного процесса совместно с MtLYK3 (Arrighi et al. 2006; Bensmihenet al., 2011).

Действительно, развитие реакции гиперчувствительности было показано присовместном синтезе MtNFP и MtLYK3 в листьях N. benthamiana (Pietraszewska-Bogiel et al.,2013), что соответствует данным, полученным нами для Sym10 и Sym37. Недавно спомощью FRET анализа было показано формирование комплекса MtNFP/ MtLYK3 in vivo,данный комплекс контролировал развитие инфекции (Moling et al. 2014).

Таким образом,при развитии симбиоза у гороха могут формироваться два рецепторных комплексаSym10/K1 и Sym10/Sym37, активирующихся на разных этапах развития симбиоза.3.3.2. Анализ взаимодействий белков с помощью дрожжевой двугибриднойсистемы.Еще одним традиционным методом изучения взаимодействия белков является анализс помощью дрожжевой двугибридной системы. Наличие набора контрольных векторовпозволяет оценить не только наличие самого взаимодействия между белками, но и его силу.Ранее анализ с помощью дрожжевой двугибридной системы был использован длядоказательства формирования гомо- и гетероолигомерных комплексов между LysM-РПКOsCERK1 и OsCEBiP у риса, необходимых для развития защитных реакций при узнаваниихитина и хитоолигосахаридов (Shimizu, 2010), а также между OsCERK1 и рецепторамиOsLYP4 иOsLYP6, необходимых для узнавания муреина и его производных (Kouzai et al.2014).Метод основан на использовании фактора транскрипции GAL4, который состоит издвух доменов AD (Activation Domain – активирующий домен) и DB (от англ.

DNA-binding– ДНК-связывающий). Физическое разделение этих доменов приводит к инактивациифактора транскрипции. Если последовательности генов, кодирующие изучаемы белки,слить в одну рамку считывания с последовательностями, кодирующими отдельные доменыфактора транскрипции, то при взаимодействии между исследуемыми белками происходитсборка фактора транскрипции и запускается экспрессия репортерных генов, определяющихспособность дрожжей расти на среде без гистидина и урацила (Рисунок 10).78Рисунок 11.