Автореферат (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 3

Различия между мутантной линией и растениямидикого типа достоверны (P> 0,95). *Были выявлены только абортированныеинфекционные нити в маленьких корневых волосках (Nod-- фенотип). ** Развитиебольшинства выявленных инфекционных нитей были абортировано в эпидермисе.9У линий 885 и 817 не было выявлено клубеньков на корнях в ответ наинокуляцию (Nod- фенотип). У линии 2265 на 14 дпи количество клубеньков былосравнимо с количеством клубеньков у растений дикого типа (38,7 ± 3,1 на 1растение у линии 2265 и 41,7 ± 5,2 у дикого типа), однако, только часть из них(22,3 ± 3,7) была инфицирована или находилась на начальной стадии заражения(Рис.

5Б). На 21 дпи число клубеньков было сравнимо с количеством у дикого типа(43±0.97 у линии 2265 и 46.57±1.23 у дикого типа; P <0.05), структура клубеньковне отличалась от структуры клубеньков у растений дикого типа (Рис. 5 Г, Д).Рисунок 2. Фенотипический анализ мутантной линии 885 по гену к1. А –внешний вид растений линии 885, инокулированных R. leguminosarum bv. viciaeCIAM 1026-gusA на 21 дпи (Nod- фенотип). Б – внешний вид корневых волосков бездеформаций.

В – редкие ветвления корневых волосков. Г, Д – формированиеабортивных ИН, связанных с маленькими корневыми волосками. Шкала – Б –200мкм, В, Г, Д - 50 мкм. ИН – инфекционная нить.У линии 817 мутация в гене к1 приводила к нарушению развитияинфекционных нитей: нарушалась полярность их роста, поэтому они часто имелиsac-подобное строение (от англ.

sac – мешок). Наблюдали формированиепримордиев клубеньков, однако они оставались неинфицированными из-заотсутствия выхода бактерий из инфекционных нитей (Рис. 3).Анализ мутантной линии 2265 показал нарушение развития инфекционныхнитей из-за изменения полярности роста (Рис. 4A). Это приводило к значительнойзадержке развития инфекции на 14 дпи - снижению количества клубеньков иувеличенному по сравнению с диким типом количеством инфекционных нитей(322 ± 25,1 на растение у линии 2265 и 115,8 ± 12,3 у дикого типа) на 14 дпи.Таким образом, в результате проведенного анализа были выявлены 3различные мутантные линии по гену к1, при этом у двух линий мутацииприводили к нарушению развития клубеньков (Nod- фенотип). Это подтверждаетгипотезу об участии К1 в развитии симбиоза гороха с ризобиальными бактериями.10Рисунок 3.

Фенотипический анализ мутантной линии 817 по гену k1. I.Микроскопический анализ 817 линии. А – внешний вид корней линии 817,инокулированных ризобиями на 21 дпи (Nod- фенотип), Б - скрученный корневойволосок с инфекционной sac-подобной нитью, В, Г – примордий клубенька на 21 дпи, Д- рост sac-подобной ИН без выхода бактерий. Шкалы - Б, В - 50 мкм, Г, Д – 100 мкмII.

Гистохимический анализ 817 линии. А – ИН и отсутствие выхода бактерий изИН и инфекционных капель (бактерии и ядра синие), Б, В –отсутствие выходабактерий из ИН (нить – желтая, бактерии – зеленые). Г – 3D реконструкция ИН(бактерии и ядра растительных клеток голубые) показала отсутствие выходабактерий из ИН, Д – Отсутствие выхода бактерий из ИН. Шкалы – A, Г, Д - 20 мкм,Б, В - 10 мкм. ПК – примордий клубенька, ИН - инфекционная нить, ИК –инфекционная капля, РЯ – растительное ядро. Толщина срезов – 50мкм. Белымистрелками отмечены ИН, инфекционные капли и ядра растительных клеток..11Рисунок 4.

Фенотипический анализ мутантной линии 2265 по гену k1. А– формирование клубенькового примордия и развитие sac-подобной ИН умутантной линии 2265 на 14 дпи, Б – развитие инфицированного клубенька улинии 2265, В – внешний вид корней линии 2265 на 21 дпи, Г - продольный срезклубенька линии 2265 на 21 дпи, Д - продольный срез клубенька растений исходнойлинии Cameor на 21 дпи. ИнК – инфицированные клетки.

ИН – инфекционныенити. Шкалы - A, Б – 50 мкм, Г, Д -100 мкм. Толщина срезов – 50 мкм.3. Анализ взаимодействия LysM-РПК Sym10, Sym37 и К1 гороха притрансформации листьев N. benthamiana для временного синтеза белка.Получение генетических конструкций для синтеза белков К1 и Sym10 выполненодиссертантом самостоятельно. Эксперименты по трансформации листьев N. benthamiana былипроведены под руководством внс Долгих Е.А.Для трансформации были использованы два различных штамма A.tumefaciens LBA 4404 и GV3101.

Инфильтрация агробактерий, содержащихконструкции для синтеза белков, слитых с флуоресцентными белками – желтым(YFP) и красным (RFP), приводила к их появлению в плазматической мембранеклеток листьев при моно-трансформации, что соответствует представлению о том,что они являются трансмембранными рецепторами (Рис.5). О синтезе белковсвидетельствовали результаты вестерн-блот анализа с антителами против RFP иYFP. Были выявлены белки с ожидаемой молекулярной массой (Рис. 5). Прииспользовании штамма LBA4404 синтез был более эффективным по сравнению соштаммом GV3101 (Рис. 5). Для того, что избежать подавления синтеза белков притрансформации N. benthamiana дополнительно вносили вектор, необходимый длясинтеза P19 (вирусного белка).

При использовании P19 было показано увеличениеуровня синтеза белков (Рис. 5). Реакция гиперчувствительности не развиваласьпри моно-трансформации K1 и Sym10.Рисунок 5. Синтез К1-RFP, Sym10-YFP и Sym 37-YFP в листьях N.benthamiana с использованием конструкций с промотором CaMV 35S. А –локализация полноразмерных белков в плазматических мембранах. Реакциягиперчувствительности при моно-трансформации не развивалась.

Б – Вестернблот-анализ К1, Sym10 и Sym 37 белков в листьях N. benthamiana с помощью антиRFP и анти-YFP антител.На следующем этапе был осуществлен совместный синтез белков вразличных комбинациях. Было показано, что совместный синтез Sym10/K1 иSym10/Sym37 приводит к развитию реакции гиперчувствительности через 48часов после трансформации (появление «мокнущих» участков в результате12разрушения клеток), что сопровождается некрозом тканей листьев через 5-6 дней(Рис.6). В качестве контроля был использован LRR-рецептор Sym19 с активнымкиназным доменом, который участвует в передаче сигнала от Nod-фактора присимбиозе (Schneider et al, 1999). Однако совместный синтез Sym10/Sym19 невызывал развитие реакции гиперчувствительности. Поскольку синтез отдельныхбелков не приводил к гибели клеток, можно сделать вывод о том, что развитиереакции гиперчувствительности является специфичной реакцией при совместномсинтезе изучаемых белков.

Развитие такой реакции свидетельствует о том, чтоданные рецепторы могут активировать путь передачи сигнала, ведущий кразвитию иммунного ответа у не бобового растения. Отсутствие реакции присовместном синтезе Sym10/Sym19, показывает специфичность взаимодействиямежду изучаемыми белками. Вместе с тем, мы наблюдали развитие реакциигиперчувствительности при совместном синтезе Sym10/Sym37, что указывает нато, что Sym10 способен взаимодействовать с двумя структурно сходными LysMРПК К1 и Sym37. У мутантов по гену sym37 нарушение развития симбиозанаблюдается на стадии формирования инфекционных нитей, что указывает научастие рецептора Sym37 в контроле инфекционного процесса у гороха (Zhukov etal., 2008).

Способность Sym10 формировать комплекс с Sym37, необходимым дляразвития инфекции, позволяет предположить, что Sym10 также может бытьвовлечен в контроль развития инфекции.Рисунок 6. Анализ развития реакции гиперчувствительности привременном синтезе белков в листьях N.

benthamiana LysM-РПК Sym10, K1 иSym37. Синтез был осуществлен в результате трансформации листьевштаммами A. tumefaciens. Развитие реакции гиперчувствительности наблюдалипри совместном синтезе Sym10/ K1 и Sym10/ Sym37 и не наблюдали при синтезеSym10/ Sym19.4. Анализ взаимодействий белков с помощью дрожжевой двугибриднойсистемы.Все изучаемые LysM-РПК гороха имеют трансмембранные домены исигнальные пептиды, которые могут быть узнаны дрожжевой транспортной13системой.

Поскольку взаимодействие белков в ДДС происходит в ядрах дрожжей,было проанализировано взаимодействие только внеклеточных доменов (ECD)Sym10, K1 и Sym37 (без сигнальных пептидов и трансмембранных доменов) (Рис.7). Внеклеточный домен AtCERK1 арабидопсиса был использован как контроль,поскольку является рецептором, не участвующим в развитии симбиоза. Былопоказано, что Sym10-ECD может взаимодействовать с K1-ECD и Sym37-ECD, ноне образует комплекса с AtCERK1-ECD. Эти позволяет сделать вывод о том, чтомежду внеклеточными доменами Sym10 и K1, а также Sym10 и Sym37 могутформироваться гетероолигомерные комплексы. Это согласуется с данными,полученными при совместном синтезе этих рецепторов в листьях N.

benthamiana.Также было выявлено сильное взаимодействие между Sym37-ECD и CERK1-ECD.При этом между K1-ECD и CERK1-ECD наблюдали только слабую реакцию (Рис.7). Это может свидетельствовать о роли Sym37 и K1 не только в развитиисимбиоза, но и в регуляции симбиоза с грибами арбускулярной микоризы ииммунном ответе растений при патогенезе. Сильное взаимодействие Sym37-ECD иCERK1-ECD может также свидетельствовать о том, что СERK1-подобный белоксовместно с Sym37 может быть вовлечен в работу на поздних этапах симбиоза.Также было показано, что мутация в линии 2265 не оказывает влияние навзаимодействие внеклеточного домена К1 с Sym10, тогда как мутация в линии 817,напротив, приводит к невозможности такого взаимодействия.Рисунок 7.

Анализ взаимодействия внеклеточных доменов LysM-РПК K1,Sym37 и Sym10 гороха с помощью дрожжевой двугибридной системы. Послетрансформации дрожжей штамма S. cerevisiae Mav203 конструкциями длясинтеза белков анализировали возможность их роста на селективной среде безлейцина и триптофана (проверка на наличие двух векторов в клетках дрожжей).Рост на селективной среде в присутствии 50мМ 3AT (3-амино-1,2,4-триазол)указывает на наличие взаимодействия. В качестве контроля были использованывекторы, предложенные производителем (Invitrogen).5.

Сравнительный анализ роли рецепторов К1 и Sym37 у гороха приразвитии симбиоза.145.1 Комплементация гена К1 мутантной линии 817 полноразмернойпоследовательностью этого гена исходной линии Cameor.Для анализа возможности мутантов по гену k1 восстанавливать способностьформировать симбиоз была проведена трансформация растений линии 817конструкциями, содержащими полноразмерную последовательность гена K1 иSym37 исходной линии Cameor. Безинтронные последовательности генов быликлонированы в вектор pB7WG2D под промотором 35S.