Автореферат (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур)

На правах рукописиКириенкоАнна НиколаевнаИЗУЧЕНИЕ РОЛИ РЕЦЕПТОР-ПОДОБНОЙ КИНАЗЫ К1 ГОРОХАВ КОНТРОЛЕ ФОРМИРОВАНИЯ СИМБИОТИЧЕСКИХСУБКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР03.01.05 Физиология и биохимия растений03.02.03 МикробиологияАвтореферат на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург — 2018Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной биологииФедерального государственного бюджетногонаучного учрежденияВсероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственноймикробиологии, г. Санкт-ПетербургНаучный руководитель: доктор биологических наукДолгих Елена АнатольевнаОфициальные оппоненты:Чумаков Михаил Иосифович, доктор биологических наук,заведующий лабораторией биоинженерии ФГБУН Институтбиохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАНМарданов Андрей Владимирович, доктор биологических наук,заведующий лабораторией геномики микроорганизмов иметагеномики Федерального исследовательского центра«Фундаментальные основы биотехнологии» РАНВедущая организация: ФГБУН Ботанический институт им.

В.Л.Комарова РАНЗащита состоится2018 г. вна заседании диссертационного советаД 999.167.02 по защите докторских и кандидатских диссертаций приСанкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034Санкт-Петербург, Университетская наб.7/9, СПбГУ, Биологический факультет,ауд. №С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М. Горького СанктПетербургского государственного университета и на сайте http://spbu.ru.Факс для отзывов: +7(812) 470-43-62Автореферат разослан «____» ___________2018 г.Учёный секретарьдиссертационного советаШарова Елена ИгоревнаОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность работы.

Изучение молекулярных механизмов восприятияклеткой внешних сигналов и формирования функционального ответа являетсяодной из основных задач биологии. Проведение таких исследований направленона лечение заболеваний, связанных с изменениями в восприятии клеткамивнешних сигналов - диабет, рак, болезнь Альцгеймера (Pires-daSilva et al., 2003).Известно, что за узнавание сигналов в клетке отвечают белки - рецепторы,которые активируют внутриклеточные мишени. Зачастую заболевания,сопряженные с изменением восприятия клеткой сигналов, связаны с мутациями врецепторах (Pires-daSilva et al., 2003).

Именно поэтому исследованияактивационных механизмов работы рецепторов лежат в основе современныхбиомедицины и фармакологии.Не только у животных, но и у растений восприятие клетками сигналовнеобходимо для быстрой адаптации. Идентификация и изучение рецептороврастений значительно отстает от исследований, проведенных на млекопитающих.В связи с этим большой интерес представляет изучение рецепторов растений, длякоторых известна функция лигандов.Среди сигнальных молекул, играющих важную роль в развитиивзаимодействий растений с микроорганизмами, особое значение имеютсоединенияпроизводныехитина–хитоолигосахаридыилипохитоолигосахариды.Такиемолекулывыделяютпатогенныеисимбиотические микроорганизмы, при этом они очень похожи по своей структуре,однако вызываемые ими ответные реакции противоположны.Индукторами развития симбиоза между бобовыми растениями и бактериямипорядка Rhizobiales являются бактериальные липохитоолигосахариды – Nodфакторы.

Они состоят из нескольких остатков N-ацетилглюкозамина (3–6),соединенных β-1,4-гликозидной связью, содержат жирную кислоту наневосстанавливающем конце, а также ряд других заместителей (Spaink, 1991;Denarie et al., 1993). В результате взаимодействия с Nod-факторами у растенийактивируется комплекс ответных реакций, что приводит к развитию на корняхазотфиксирующих клубеньков. До сих пор представления о молекулярныхмеханизмах рецепции Nod-факторов остаются далекими от понимания.

Этоопределяет актуальность и важность поиска рецепторов к этим сигнальныммолекулам, а также изучения принципов их работы.Оказалось, что в узнавание Nod-факторов могут быть вовлечены рецепторподобные киназы с LysM-мотивами во внеклеточном домене (LysM-РПК).Впервые они были выявлены у лядвенца японского Lotus japonicus - LjNFR5 иLjNFR1, обе они необходимы для инициации развития симбиоза (Madsen et al.,2003; Radutoiu et al., 2003; 2007).

Позже гомологи генов LjNFR5 и LjNFR1 былинайдены и у других бобовых растений - люцерны слабоусеченной Medicagotruncatula Gaertn. (MtNFP и MtLYK3) и гороха посевного Pisum sativum L.(PsSym10 и PsSym37) (Madsen et al., 2003; Zhukov et al., 2008). Исследования повлиянию ризобий, выделяющих Nod-факторы с измененной структурой, показали,что их рецепция у гороха и люцерны может быть организована более сложнымобразом, чем у L.

japonicus. Была предложена гипотеза: в распознавание Nodфакторов у этих растений вовлечены два типа рецепторов, контролирующих3разные этапы развития симбиоза. Один из рецепторов, «сигнальный»,контролирует развитие ранних симбиотических реакций, а другой - рецептор«проникновения» - вовлечен в регуляцию более поздних стадий симбиоза(развитие инфекции и органогенез клубенька). Это предположение согласуется санализом мутантов люцерны и гороха по генам, кодирующим LysM-РПК. Анализмутантов показал, что MtNFP и PsSym10 могут быть необходимы для инициациисимбиоза, тогда как MtLYK3 и PsSym37 контролируют более поздние стадииразвития симбиоза.Однако данные о том, что MtNFP и PsSym10 обладают неактивнымикиназными доменами (не способны к авто- и трансфосфорилированию) (Madsen etal., 2003), а также представление о том, что для активации трансмембранныхрецепторов необходима их олигомеризация, указывают на участие в контролеразвития симбиоза дополнительных рецепторов, которые остаются неизвестными.Это определяет необходимость поиска дополнительных рецепторных киназ,участвующих в передаче сигнала от Nod-фактора, и дальнейшего изученияорганизации рецепторов и механизмов их активации.Ранее у гороха были выявлены кандидаты на роль таких рецепторов.Сравнительный анализ развития симбиоза у европейских и афганских сортовгороха позволил выявить ген Sym2, определяющий штаммо-специфичныйхарактер инокуляции (Разумовская, 1931).

Необходимость выделения штаммами,заражающими афганские сорта гороха, Nod-факторов с ацетилом наневосстанавливающем конце молекулы, предполагает функцию Sym2 в качестверецептора к этим молекулам. Однако до настоящего времени последовательностьгена Sym2 гороха остается не известной.Более того, при скрининге библиотеки кДНК инокулированных корнейгороха с помощью LjNFR1, помимо Sym37, был выявлен также ген K1,кодирующий LysM-РПК с полноценной киназой.

Это определило значительныйинтерес к выяснению роли этого рецептора в развитии симбиоза.Наличие у гороха большого числа LysM-рецептор-подобных киназ делаетего удобной моделью для изучения рецепции Nod-факторов и позволяетподтвердить или опровергнуть гипотезу о двухэтапном распознавании этихсигналовубобовыхрастенийснедетерминированнымтипомклубенькообразования.Цель исследования.

Основной целью диссертационной работы являлосьизучение роли LysM-РПК К1 у гороха P. sativum L. при развитии симбиоза склубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae.Задачи работы:1.Анализ уровня экспрессии гена К1 при развитии клубеньков спомощью метода количественной ОТ-ПЦР.2.Выявление с помощью TILLING подхода мутантов по гену k1 и ихгенотипическая и фенотипическая характеристика.3.Комплементация мутантных генов k1 и sym37 c помощьюполноразмерных последовательностей этих генов гороха дикого типа дляпроверки функциональной взаимозаменяемости.4.Анализ способности рецептор-подобной киназы К1 формироватьолигомерные комплексы с другими известными рецепторными киназами гороха4Sym10 и Sym37 в различных гетерологичных системах (модифицированныйFRET-анализ и дрожжевая двугибридная система).5.Построение схемы работы рецепторов к Nod-факторам у гороха.Научная новизна.

В ходе выполнения данной работы была впервыеизучена роль новой LysM-РПК К1 гороха в контроле развития симбиоза склубеньковыми бактериями. Впервые были найдены с помощью TILLING подходаи фенотипически описаны мутанты по гену k1.

Наличие двух мутантов с Nodфенотипом и данные по комплементации позволили сделать вывод о том, что К1необходим для контроля развития симбиоза у гороха. При этом впервые у бобовыхс недетерминированным типом клубеньков охарактеризован рецептор с активнымкиназным доменом, который в составе гетеролигомерного комплекса участвует винициации развития симбиоза. Впервые предложена модель работы несколькихолигомерных рецепторных комплексов, участвующих в узнавании Nod-факторов угороха.Теоретическое и практическое значение. Полученные в работе данныепозволяют предложить новую схему организации работы LysM-содержащихрецепторов при развитии симбиоза гороха с ризобиямиВыполнение работы было поддержано: грантом РФФИ мол_а 16-34-01070и РНФ 16-16-10043Апробация работы.

По результатам работы были представлены докладына 16 и 17-ой Международной Пущинской школе - конференции молодых ученых«Биология – наука ХХI века» в 2012 и 2013 (г. Пущино), постерные доклады на 19и 20 международном конгрессе по азотфиксации.Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 7тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себявведение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования,результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (203 источника). Работаизложена на 112 страницах, содержит 15 рисунков и 7 таблиц.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методы исследованияШтаммы микроорганизмов. Для стандартных процедур клонированияиспользовали E. coli DH5α.

Для инокуляций растений гороха был использованмеченый gusA штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM 1026 (WDCM 966),предоставленный Ахтемовой Г.А. (ФГБНУ ВНИИСХМ). Для трансформациигороха использовали штамм Agrobacterium rhizogenes Arqua 1. Трансформациюлистьев Nicotiana benthamiana проводили с помощью штаммов Agrobacteriumtumefaciens LBA4404 (предоставлен доктором Cullimore, Тулуза, Франция) и A.tumefaciens GV3101:pMP90(RK), предоставленный в.н.с.