Автореферат (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 2

Захарченко Н.С. (филиалинститута биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова, Пущино,Россия). При работе с дрожжевой двугибридной системой использоваликоммерческий штамм Saccharomyces cerevisiae MaV203 (Invitrogen, США).Условия культивирования микроорганизмов. Штаммы E. coliкультивировали на среде LB (Bertani, 1951) при 37˚С. Штаммы ризобий5культивировали в жидкой среде YEB (Krall et al. 2002) при 28˚С.

ШтаммыAgrobacterium культивировали в среде TY (Beringer et al., 1974) при 28˚С. Штаммдрожжей MaV203 выращивали на среде YPD (Murthy et al., 1975). Селекцию прианализе взаимодействий белков с помощью ДДС вели на синтетической среде (SC,Invitrogen, США) в отсутствии селектирующих агентов.Условия выращивания растений.

Семена Nicotiana benthamianaстерилизовали 5 мин 10% гипохлоритом натрия, затем промывали 5 раз водой.Растения выращивали 3 недели при +25°C, длительность светового дня - 16ч, 60%влажности. Семена гороха стерилизовали 5 мин концентрированной сернойкислотой, затем 5 раз промывали водой 5.

Семена проращивали на 1% водномагаре в темноте в течение 4-5 дней при комнатной температуре. Послепрорастания растения переносили в горшки с вермикулитом, политым жидкойсредой Jensen (van Brussel et al.,1982). Растения выращивали при +21ºС,длительности светового дня - 16 ч, 60% влажности. Инокуляцию проводили,добавляя 1 мл суспензии R. leguminosarum bv. viciae CIAM 1026 (OD600 = 0,5).Количественная ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией (qRTPCR). Выделение РНК проводили с помощью реагента PureZol (Bio-Rad, США).кДНК была синтезирована из 2,5 мкг РНК с помощью обратной транскриптазыRevertAidH-(Thermo Scientific, США) с использованием олиго(дT) праймеров.

ПЦРв реальном времени проводили с использованием прибора CFX96 Real-TimeSystem (Bio-Rad) и смеси qPCRmix-HSSYBR (Евроген, Россия. Уровень мРНК былнормализован относительно убиквитина и актина. Значения уровней экспрессиибыли представлены как отношения уровней экспрессии генов в варианте синокуляцией к контролю (растениям без инокуляции).Создание конструкций для трансформации растений и дрожжей. Длясоздания конструкций использовали специфические праймеры и метод сиспользованием эндонуклеаз рестрикции и последующего лигирования, либо спомощью метода гомологичной рекомбинации.

Амплификацию генов проводили спомощью высокоточной полимеразы PhusionFlash. Полученные плазмиды вводилив клетки E. coli методом электротрансформации. Доменная структура изучаемыхбелков была предсказана с использованием TMHММ Serverv. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHММ).Последовательностьсигнальногопептида выявляли, пользуясь сервером - http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP.Временная трансформация листьев Nicotiana benthamiana.

A. tumefaciensLBA 4404 или GV3101:pMP90 (RK), несущие векторы для экспрессииполноразмерных копий генов, выращивали ночь в жидкой среде TY при 28ºC,осаждали при 2000g и ресуспендировали в буфере (10мМ MES-KOH, 10мМ MgCl2и 0.5 мМ ацетосирингон) до плотности культуры OD600 = 0.5. Для трансформациибрали 2-3 лист от земли. Иголкой делали прокол в листьях, прижимая к меступрокола шприц, вводили бактерии. Растения анализировали через 48 – 96 ч послеинфильтрации.

Локализацию белков наблюдали, используя конфокальныйлазерный сканирующий микроскоп (LSM 510 META NLO, CarlZeiss).Выделение белков из листьев N. benthamiana, электрофорез белков вПААГ и вестерн-блот гибридизация. Белковые пробы, полученные из листьев,разделяли в 12% ПААГ по методу Laemmli (1970) и переносили нанитроцеллюлозу. Для детекции белков использовали антитела к YFP и RFP6(Invitrogen). Для визуализации использовали антитела против IgG кролика,конъюгированные с пероксидазой. Полосы выявляли после реакции с 4-хлор-1нафтолом.Трансформация растений с помощью A.

rhizogenes. У 10-дневныхпроростков гороха обрезали корень в области гипокотиля, на место среза наносилибактерии. Проростки помещали в стеклянную банку с твердой средой Йенсен агари инкубировали в течение 10-12 дней в фитотроне при +21°C, влажности 60% ирежиме день/ночь 16/8 ч.

После формирования каллуса растения переносили насреду Emergence (Limpens et al., 2004) c цифотоксином (150 мкг/мл) дляподавления развития агробактерий. Через неделю растения переносили на средуEmergence без антибиотика на 4-5 дней для развития корней. Затем растенияпереносили в вермикулит и инокулировали R. leguminosarum bv. viciae CIAM1026.Дрожжевой двугибридный анализ. Для анализа использовали систему наоснове GAL4 транскрипционного фактора (Invirogen, США). Взаимодействиебелков определяли по способности дрожжевых колоний расти на селективныхсредах.

Оценку силы взаимодействия вели с помощью контрольных плазмид,предложенных производителем.Поиск мутантных линий с помощью метода индуцированныхлокальных нарушений в геномах (TILLING). Поиск мутантов был осуществленс помощью методики TILLING (от англ. Targeting Induced Local Lesionsin Genomes— поиск индуцированных локальных нарушений в геномах). Анализ проведен наTILLING платформе группы исследования геномики растений (URGV, INRA,Франция). Изменения в аминокислотном составе, которые могут повлиять нафункцию белка, были предсказаны с помощью программы SIFT.

Мутантныелинии были получены в M5 поколении и проверены на гомозиготность по гену K1.Гистохимическая окраска и микроскопия. Корни и клубенькиокрашивали в течение ночи при +37°C циклогексиламмониевой солью 5-бром-4хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронид (X-Gluc) (Fermentas, США) (Voroshilova et al.,2001). Фиксацию окрашенных корней и клубеньков, а также получение срезовпроводили по методу, описанному (Kitaeva et al., 2016). Использовались антителаМAC57 против компонентов ризобиальной клеточной стенки и MAC265 противинфекционных нитей, в качестве вторых антител использовали AlexaFluor 488(Thermo Fisher Scientific).

Срезы были проанализированы с помощью лазернойсканирующей конфокальной системы LSM 510 META (CarlZeiss, ФРГ).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ1.Анализ экспрессии гена K1 у гороха в процессе развития симбиоза сризобиями с помощью количественной ОТ-ПЦР.Для изучения роли К1 в развитии симбиоза был оценен уровень экспрессиикодирующего ее гена K1 в ответ на инокуляцию ризобиями, с 1 до 28 день послеинокуляции (дпи), с помощью количественной ОТ-ПЦР (Рис.1). Было проведеносравнение с уровнями экспрессии генов Sym10 и Sym37, кодирующих другиеизвестные LysM-РПК, для которых ранее было уже показано участие в симбиозе(Madsen et al., 2003, Zhukov et al., 2008). Анализ показал, что экспрессия K1увеличивалась на ранних этапах в 1,8 раза (2 дпи), но в дальнейшем уровеньэкспрессии изменялся мало (Рис. 2).

Однако несколько увеличенным уровень7экспрессии был в клубеньках 14 дпи (в 1,5 раза). Сходным образом уровеньэкспрессии Sym10 начинал повышаться на 2 дпи (в 3,1 раза), достигая максимумана 4 дпи, а затем оставался высоким на последующих этапах, а также в зреломклубеньке (14 – 21 дпи). Экспрессия гена Sym37 также увеличивалась на раннихсроках (начиная со 2 дпи, в 2,8 раза), однако наиболее существенно онавозрастала, начиная с 5 дпи и достигая максимума на 14 дпи.

Таким образом, всетри гена K1, Sym10 и Sym37 показали повышенный уровень экспрессии наначальных этапах формирования симбиоза и в процессе развития клубеньков.Следовательно, активация гена К1 может свидетельствовать о его вовлечении вконтроль как ранних, так и более поздних этапов развития симбиоза.Рисунок 1. Анализ экспрессии генов K1, Sym10 иSym37 при инокуляциигороха с помощью количественной ОТ-ПЦР. Бары - ± SEM трех аналитическихповторностей. На оси ординат указаны значения отношения уровней экспрессиигенов в варианте с инокуляцией к контролю (варианте без инокуляции)(количество раз).2.Поиск мутантов гороха по гену k1 с помощью TILLING подхода, ихгенотипическая и фенотипическая характеристика.Подбор праймеров и условий их работы для поиска в коллекции TILLING мутантов,выполнен диссертантом самостоятельно.

Фенотипическая и генотипическая характеристикамутантных линий выполнена под руководством внс Долгих Е.А.Поиск мутантов по гену к1 был проведен с помощью TILLING подхода.Поиск проводили для 4 фрагментов гена (размером около 400 п.о.). Проведенныйанализ позволил обнаружить 17 мутантных линий (Табл.1). С помощьюпрограммы SIFT среди них были выявлены 3 линии (817, 885 и 2265), у которыхмиссенс-мутации могли приводить к нарушению функции белка (Табл.2). Дляфенотипической характеристики мутантных линий проводили анализформирования у них клубеньков на корнях при инокуляции gusA- меченым R.leguminosarum bv.

viciae CIAM 1026.8Таблица 1. Результаты TILLING анализа.Таблица 2. Генотипическая характеристика мутантов по гену k1.Позиция Позиция в белке,Линия МутацияРасположениев ДНКзамена а/к817C→T571Pro169SerLysM3 мотив ECD885G→A1445Gly332AspКиназный домен2265C→T242Ser59PheLysM1 мотив ECDАнализ 885 линии показал полное отсутствие реакций на инокуляциюризобиями, наблюдалось только редкое ветвление корневых волосков (Рис.2).

Сочень низкой частотой в корнях мутанта образовывались короткие абортивныеинфекционные нити, связанные с маленькими скрученными корневыми волосками(Табл. 3), развитие которых останавливалось в эпидермисе (Рис.2).Таблица 3. Деформации, скручивания корневых волосков и ростинфекционных нитей у дикого типа Cameor, 885 и 817 мутантных линий.Деформациии скручиванияРост инфекционныхКоличествоВарианткорневыхнитейклубеньковволосковДикий тип Cameor 301,7 ± 13,48, 3 ± 2,846,57±1,2885 линия4,8 ± 1,32,8 ± 0,9*817 линия125,2 ±11,2142,2 ± 4,7 (101,8± 6,6) ** 00Данные представляют число (± SEM) деформированных и скрученныхволосков, а также количество инфекционных нитей на 21 дпи на 100 полей зрениямикроскопа (20х увеличение).