Автореферат (Изучение роли рецептор-подобной киназы К1 гороха в контроле формирования симбиотических субклеточных структур), страница 4

В качестве контроляиспользовали вектор pB7WG2D, в котором ген GUS, кодирующий βглюкоронидазу, был также клонирован под промотором 35S. Так же в качественегативногоконтроляиспользовали вектор pB7WG2D,в которомпоследовательность гена К1, несущая мутацию аналогичную мутацию в линии817, был клонирована под промотором 35S.После инокуляции растений гороха ризобиями на 28 дпи наблюдалиформирование клубеньков на трансгенных корнях, полученных притрансформации pB7WG2D-К1 (17 корней, 8,52 ± 1,05 клубеньков на один корень(P <0.05, по t-критерию Стьюдента). Формирования клубеньков не наблюдали накорнях гороха, содержащих конструкцию pB7WG2D:Sym37 (14 трансгенныхкорней) и pB7WG2D:GUS (15 трансгенных корней) (Рис.

8).Рисунок 8. Комплементация мутантной линии 817 по гену к1. Длятрансформации растений с помощью A. rhizogenes были использованыконструкции pB7WG2D:K1 (A) и pB7WG2D:Sym37 (Б), содержащиеполноразмерные кодирующие последовательности генов К1 и Sym37 исходнойлинииCameor.Вкачествеконтроляиспользовалирастения,трансформированные pB7WG2D: GUS (В) и pB7WG2D:p35S:K1:817, несущуюмутантную копию к1, в которой мутация соответствовала мутации в линии 817.Образование клубеньков оценивали на 28 дпи. Шкала: 2 мм.Полученные данные свидетельствуют о том, что фенотип Nod- 817 линииопределяется только мутацией в гене k1, а не влиянием других мутаций,полученных с помощью TILLING подхода. Кроме того, неспособностьполноразмерной кодирующей последовательности гена Sym37, имеющего высокийуровень сходства с геном K1, восстанавливать способность к формированиюклубеньков, свидетельствует о разной функции кодируемых этими генамирецепторов.155.2.

Коплементация линий K24 и RisNod4, несущих мутацию по генуsym37.На основе высокого уровня сходства нуклеотидных последовательностейгенов Sym37 и K1 было выдвинуто предположение о том, что K1 и Sym37 могутфункционально замещать друг друга при развитии симбиоза. Однако ген Sym37был не способен замещать K1 у мутанта 817. Мы проверили способность K1замещать Sym37 у мутантов RisNod4 и K24 (Nod- - мутантов) с помощьютрансформации растений полноразмерными кодирующими последовательностямигенов Sym37 и K1. Результаты представлены в Таблице 4.Таблица 4.

Результаты комплементации мутантов K24 и RisNod4 погену sym37 с помощью последовательностей генов дикого типа K1 и Sym37.МутантнаялинияКонструкцияK24 (sym37 )pB7WG2D:K1RisNod4 (sym37 )ЧислоЧислотрансгенных клубеньковкорнейна 1 корне219,73 ± 2,05pB7WG2D:Sym37229,92 ± 2,16pB7WG2D:GUS27НетpB7WG2D:K1239,54 ± 1,71pB7WG2D:Sym37209,72 ± 1,55pB7WG2D:GUS25НетРисунок 9. Комплементация мутантов K24 (A, Б, В) и RisNod4 (Г, Д, Е)по гену sym37. Были использованы конструкции pB7WG2D:K1 (A, Г),pB7WG2D:Sym37 (Б, Д) и pB7WG2D: GUS (В, Е) (контроль). Трансгенныерастения были инокулированы R. leguminosarum bv. viciae CIAM 1026.Образование клубеньков проверяли на 28 дпи.

Шкалы: А, Б, Г, Д- 2 мм; В, Е- 1 мм.16При трансформации мутантов по гену sym37 полноразмернойпоследовательностью гена K1 происходило восстановление способностиформировать клубеньки (Рис. 9). Эти данные можно объяснить тем, что К1 нетолько участвует в инициации развития симбиоза, но и контролирует развитиеинфекции и эндоцитоз бактерий в клетки растений.

Можно предположить, что К1работает дополнительно на этапе уже после активации рецепторного комплексаSym10/Sym37, поэтому способен восстанавливать функцию Sym37 (Рис.10).Отсутствие восстановления этой функции у мутантов по гену sym37 in vivo можетбыть связано с тем, что работа комплексов Sym10/К1 и Sym10/Sym37 можетспособствовать выработке сигнала, который необходим для активации событий,определяющих эндоцитоз бактерий с участием рецептора К1. В пользу этогопредположения свидетельствуют данные по изучению 817.6. Гипотеза об организации работы LysM-РПК гороха при развитии симбиозас ризобиями.Рисунок 10. Схема организации работы рецепторных комплексов приузнавании Nod-факторов у гороха.В результате проведенных исследований было получено экспериментальноеподтверждение гипотезы о возможности участия двух типов рецепторов вконтроле развития симбиоза у гороха, работающих на разных стадиях этогопроцесса. На основании полученных результатов может быть предложена модельработы не отдельных рецепторов, а олигомерных рецепторных комплексовSym10/К1 и Sym10/Sym37, контролирующих развитие симбиоза.

При этомкомплекс Sym10/К1 необходим для инициации симбиоза. РецепторыSym10/Sym37 могут участвовать в регуляции развития инфекционного процесса угороха (инициации роста инфекционных нитей). Следует отметить, что ранееспособность контролировать развитие инфекции, зависимым от структуры Nodфакторов образом, была показана для линий гороха афганского и европейскогопроисхождения, несущих разные аллели гена sym2 (sym2A и sym2E).

В такомслучае, в составе олигомерного рецепторного комплекса Sym10 и Sym37 можетбытьещедополнительныйрецепторSym2(Sym10/Sym37/Sym2),контролирующий развитие инфекционного процесса (Рис. 10). С активацией этих17комплексов у гороха может быть связано появление дополнительного сигнала,который необходим для эндоцитоза бактерий из инфекционных нитей, в контролекоторого вновь принимает участие рецептор К1.ВЫВОДЫ1. На основании анализа экспрессии гена К1 методом количественной ОТПЦР показано, что этот ген необходим для развития симбиоза у гороха.2. С помощью TILINNG подхода выявлено 3 мутантных линии гороха 817,885 и 2265, несущих мутации в гене к1.

Фенотипическая характеристикамутантных линий показала, что LysM-рецептор-подобная киназа К1 необходимадля инициации развития симбиоза у гороха, а также контролирует выход бактерийиз инфекционных нитей.3. Показана возможность формирования гетероолигомерных рецепторныхкомплексов между LysM- рецептор-подобными киназами K1 и Sym10, а такжеSym10 и Sym37 при совместном синтезе в листьях N. benthamiana, а также вдрожжевой двугибридной системе.4. Эксперименты по трансформации мутантов гороха по генам к1 и sym37конструкциями, содержащими полноразмерные последовательности этих генов,показали, что рецепторы K1 и Sym37 могут контролировать разные этапыразвития симбиоза.5.

Предложена новая модель функционирования рецепторов к Nod-фактораму гороха с участием нескольких рецепторных комплексов.Список публикаций по теме диссертации:Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:1. Кириенко А., Леппянен И., Долгих Е.А. Особенности организации ифункционирования у растений уникального класса рецепторных киназ,содержащих LysM-мотивы во внеклеточных доменах // Экологическая генетика.2013.

Т.9, №4. С.12-22.2. Azarakhsh M., Kirienko A., Zhukov V., Lebedeva M., Dolgikh E., Lutova L.KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX 3: a new regulator of symbiotic noduledevelopment // J. Exp. Bot. 2015. V.22. P.7181-95. doi: 10.1093/jxb/erv414.3. Долгих Е., Кириенко А., Леппянен И., Долгих А. Роль фитогормонов в контролеразвития симбиотических клубеньков у бобовых растений.

Цитокинины (обзор)// Сельскохозяйственная биология. 2016. Т.51, № 3. С.285-298. doi:10.15389/agrobiology.2016.3.285rus.4. Долгих Е., Кириенко А., Леппянен И., Долгих А. Роль фитогормонов в контролеразвития симбиотических клубеньков у бобовых растений. Ауксины (обзор) //Сельскохозяйственная биология. 2010. Т.51. № 5. С. 585-592.

doi:10.15389/agrobiology.2016.5.585rus.5. Кириенко А., Леппянен И., Грибченко Э., Долгих Е. Особенности выделениябелков для анализа протеома растений гороха Pisum sativum L. при симбиозе склубеньковых бактерий // Сельскохозяйственная биология. 2017. Т.52, №5.С.1012-1020. doi: 10.15389/agrobiology.2017.5.1012rus.6. Долгих Е., Кириенко А., Ковалева О., Тихонович И.А. Изучение биохимическойфункции рецептор-подобных киназ гороха sym10, sym37 и k1, необходимых дляразвития бобово-ризобиального симбиоза // Экологическая генетика. 2017. Т.15, №4.

С. 4-12. http://dx.doi.org/10.17816/ecogen1544-12.187. Kirienko A., Porozov Y., Malkov N., Akhtemova A., Le Signor C., Thompson R.,Saffray C., Dalmais M., Bendahmane A., Tikhonovich I., Dolgikh E. Role of aReceptor-Like Kinase K1 in Pea Rhizobium Symbiosis Development // Planta. 2018. –в печатиТезисы:1. Кириенко А., Долгих Е. Изучение организации и связывающей способности слигандами трансмембранных рецепторов гороха SYM37, SYM10 и K1 приэкспрессии в гомологичной системе – листьях N. benthamiana// БИОЛОГИЯ –НАУКА ХХI ВЕКА: 16-я Международная Пущинская школа-конференциямолодых ученых.

Сборник тезисов. 2012. С. 466.2. Кириенко А., Порозов Ю., Долгих Е. Роль новой LysM-РПК K1 гороха вразвитии симбиоза с клубеньковыми бактериями // БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХIВЕКА: 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых.Сборник тезисов. 2013. C. 199.3. Kirienko A., Leppyanen I., Porozov Y., Dolgikh E. LysM-receptor-like kinase K1 – anew component involved in pea-rhizobium symbiosis development // 19-thInternational Congress on Nitrogen Fixation (Pacific Grove, CA, USA, 4-9 October,2015).

Р.137.4. Кириенко А., Долгих Е. Изучение роли LysM-РПК К1 гороха в развитиисимбиоза с клубеньковыми бактериями // БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА:20-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых.Сборник тезисов. 2016. С. 352-353.5. Долгих Е., Кириенко А., Порозов Ю., Тихонович И.А.

Анализ способностиLysM-рецепторных киназ гороха P. sativum L. различать сигнальные молекулыризобий Nod-факторы //Научные труды V съезда физиологов СНГ, V съездабиохимиков России. 2016. С. 210.6. Kirienko A., Saffray C., Dalmais M., Bendahmane B., Le Signor C., Thompson R.,Akhtemova G., Tikhonovich I., Dolgikh E. LysM-receptor-like kinase K1 controlsformation of symbiotic subcellular structure in pea-rhizobium symbiosis development// 20th International Congress on Nitrogen Fixation (Granada, Spain, 3-7 Sept.

2017).Proceedings of 20th International Congress on Nitrogen Fixation. P.23219.