Диссертация (Многофакторный анализ особенностей течения, диагностики и лечения акне средней и тяжелой степеней тяжести как основа совершенствования качества медицинской помощи), страница 12

Пациенты с 4 баллами (534 из 776 или 68,8%) были включены висследование до его завершения.622.2.2. Инструментальные методы исследования. Дерматоскопия. Для еевыполнения использовали бинокулярный микроскоп МБС-10, цифровой USBмикроскоп «Webbers digital microscope f-2cn» с увеличением 50-200 крат.Микроскоп давал возможность получать увеличенное изображение на мониторекомпьютера, что позволяло изучать структуру кожи и морфологические элементысыпи и оценивать эффективность лечения.Фотографированиеиспользованиембольных,цифровойдавшихфотокамерысогласие,«Canonосуществлялосьpowershotsx510hs»ссразрешением 12,1 мп.2.2.3.

Лабораторные методы исследованияКлиническийанализкрови:эритроциты,лейкоциты,гемоглобин,нейтрофилы, сегментоядерные лейкоциты, эозинофилы, лимфоциты, моноциты,СОЭ.Биохимическое исследование крови.липидный статус: общий холестерин, триглицериды, липопротеидывысокой плотности (ЛПВП), липопротеиды низкой плотности (ЛПНП);ферменты (аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза(АСТ), амилаза, щелочная фосфатаза);пигменты (билирубин общий, билирубин свободный, билирубинпрямой);низкомолекулярные азотистые вещества (креатинин мочевая кислота,мочевина);углеводы (глюкоза).Исследование проводили до назначения ИТ и ежемесячно в процесселечения.2.2.4. Генетические методы исследованияГенетическое исследование проводилось методом полимеразной цепнойреакции (ПЦР) в реальном времени пациентам, давшим письменное согласие до63начала лечения. Были сформированы 3 группы: 1 и 2 больные акне, 3 контрольнаягруппа (КГ).1 группа (ИТ-резистентные) – 25 пациентов, резистентных к терапии ИТ.

Уних диагностировано акне разной степени тяжести. При получении суммарнойтерапевтической дозы ИТ в течение 5 лет наступил рецидив заболевания.2 группа (ИТ-чувствительные) – 38 пациентов с акне разной степенитяжести, успешно лечившихся ИТ, при отсутствии рецидивов заболевания втечение 5 лет наблюдения;3 контрольная группа – 30 человек, не имеющих на момент исследованияклинических проявлений акне.Выделение ДНК проводилось по следующей методике.

По 8,5 мл кровисмешивали с антикоагулянтом в пробирках для сбора крови PAXgene Blood DNATubes(фирмаQiagen,Германия).Пробиркимаркировали,содержимоеперемешивали несколькими инверсиями и хранили в течение недели вхолодильнике (0-4оС) или более длительное время – в морозильной камере (18оС). ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA Blood Maxi Kit (фирмаQiagen, Германия) по прописи, рекомендуемой производителем. КонцентрациюДНК в полученных образцах измеряли с помощью флуориметра Qubit и наборареактивов Quant-iT dsDNA BR Assay Kit (фирма Invitrogen, США).Аллель-специфическая ПЦР.

Для выбора изучаемых полиморфизмов в генелипокалина-2 человека (LCN2, он же NGAL, Gene ID: 3934 в базе данных NCBI –Gene – https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3934) использовали информацию об ихнуклеотидных последовательностях и собственно точечных полиморфизмах изследующих баз данных:1.NCBI-Genes and Expression-Gene – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene.2.dbSNP – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp.3.Ensemble Human – http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index.Выбрано 4 точечных полиморфизма, которые с наибольшей вероятностьювлияют на свойства кодируемого белка. Один из них (rs113469275) связан сзаменой нормального стоп-кодона в гене дикого типа на кодон аминокислоты64аргинин.

В результате образуется удлиненный на 94 «лишних» аминокислотныхостатка белок. Известно, что консервативный для белков-липокалинов доменвключает большую часть полипептидной цепи LCN2 (45-190-й аминокислотныеостатки). Этот домен образует характерную «цилиндрическую» структуру из 8параллельных бета-цепей, в центре которой находится «карман» для связыванияспецифических лигандов. Удлинение полипептидной цепи липокалина-2 вполтора раза, скорее всего, нарушает его функциональную активность.Дополнительно исследовали три точечных полиморфизма (single nucleotidepolymotphisms–SNPs),связанныхсаминокислотнымизаменамивполипептидной цепи LCN2:1.

rs11556770 – замена глутамина в 39-м положении полипептидной цепи нагистидин,2. rs2232627 – замена пролина в 121-м положении на серин,3. rs79993583 – замена треонина в 124-м положении на метионин.Из этих трех полиморфизмов 1-ый и 3-ий связаны с неконсервативнымиаминокислотными заменами и, вероятно, серьезно нарушают функцию белка. 2ой – с консервативной заменой, скорее всего, не нарушающей функции белка. Длясоответствующих участков гена LCN2 синтезировали по 3 олигонуклеотидныхпраймера.

Один из них – универсальный, одинаково хорошо подходящий дляПЦР-амплификации данного участка в аллелях дикого и мутантного типов. Двааллель-специфических праймера, один из которых идеально соответствовалнуклеотиднойпоследовательностипоследовательностимутантногоаллеляаллеля.дикогоДлятипа,аконструированиявторой–праймеровиспользовали сетевые сервисы Primer3 – http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ и NCBIPrimer-BLAST – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi. При этомполиморфный нуклеотид соответствовал самому 3’-концевому нуклеотидуаллель-специфических праймеров. Длина аллель-специфических праймероввыбиралась таким образом, чтобы температуры их плавления были как можноближе друг к другу. Общий праймер с ориентацией, противоположной аллельспецифическим, выбирался таким образом, чтобы его температура была как65можно ближе к 60оС, а длина ожидаемого продукта ПЦР находилась в диапазонеот 70 до 250 нуклеотидных пар.

В целом комбинация праймеров считаласьприемлемой, если их температуры плавления укладывались в диапазон от 55о до65оС,атемпературыплавлениядвухаллель-специфическихпраймеровразличались не более чем на 3оС. Синтез олигонуклеотидных праймеровосуществляли в научно-производственном объединении «Синтол» (Россия).Эффективность амплификации геномной ДНК, выделенной из клеток кровипациентов с акне и индивидов контрольной группы, с каждым аллельспецифическим праймером сравнивали с помощью ПЦР с детекцией в реальномвременивприсутствиифлуоресцентногокрасителяSYBRGreenI.Дискриминацию аллелей считали достоверной, если разница в пороговых циклахмежду реакциями составляла не менее 3 циклов.

Пример кривых флюоресценции,полученных в одном из таких опытов представлена на рисунке 2.Рисунок 2 – Динамика амплификации геномной ДНК с помощью алллельспецифических праймеров.Горизонтальная прямая указывает базовый уровень флюоресценции.Пороговым циклом является тот цикл ПЦР, на котором кривая флюоресценциипересекаетбазовыйуровень.Пригомозиготномгенотипедикоготипаамплификация ДНК с помощью праймера, соответствующего аллелю дикоготипа, существенно эффективнее, чем ее амплификация с помощью праймера,66соответствующего мутантному аллелю. Пороговый цикл с этим праймеромдостигается намного раньше. При гомозиготном генотипе мутантного типакартина обратная.

При гетерозиготном генотипе оба праймера одинаковоэффективны: соответствующие пороговые циклы практически одинаковы. Такимобразом, сравнивая пороговые циклы в реакциях с аллель-специфическимипраймерами,можноопределитьгенотипкаждогоиспытуемогопосоответствующему полиморфизму.ИспользовалиПЦР«вреальномвремени»вприсутствииинтеркалирующего флуоресцентного красителя SYBR Green I (5-кратнаяготовая смесь для ПЦР qPCRmix-HS SYBR+ROX фирмы Евроген, Россия).

Всостав смеси входят следующие компоненты: Taq ДНК полимераза соспецифическими моноклональными антителами (HS Taq ДНК полимераза),красительSYBRGreenI,референсныйкрасительROX,смесьнуклеотидтрифосфатов, Mg2+, реакционный буфер. Для постановки реакциив смесь добавляли праймеры, матрицу ДНК и воду. Аллель-специфическуюПЦР проводили в детектирующем амплификаторе фирмы BioRad (США).В серии предварительных экспериментов подобраны условия, при которыхдискриминация аллелей была наилучшей: количество геномной ДНК на реакциюобъемом 20 мкл – 100 нг, конечная концентрация каждого из праймеров – 0,1мкМ. Условия ПЦР: 5 мин инкубация при 95оС для активации термостабильнойДНК-полимеразы, 40-45 циклов. Это денатурация при 94оС (45 сек), обжигпраймеров при температуре на 3оС ниже наименьшей из температур плавленияиспользуемой для данного сайта тройки праймеров (45 сек), удлинение – 72оС (1мин).

По завершении последнего цикла – финальное удлинение – 72оС (2 мин).Специфичность реакции ПЦР контролировали по кривым плавления продуктовамплификации, а также электрофорезом в агарозных гелях.2.2.5. Иммунологические методы исследованияИсследование иммунного статуса проведено 124 пациентам с различнымиформами акне. Забор крови проведен у всех больных до и после курса терапии,67через 6 мес. Взятие биоптатов кожи проведено до начала лечения с различныхпервичных морфологических элементов акне.Экспрессию эффекторов врожденного иммунитета (TLRs, α-дефенсинаHNP1) определяли в периферической крови и образцах кожи.

Для получениябиоптатов кожи с морфологических элементов использовали метод panthбиопсии, на что пациенты давали письменное согласие. Биопсия проводиласьодноразовым стерильным перфоратором (пробойником) диаметром 2 мм. Дляанестезии использовали 0,5 мл 2% раствора новокаина. У пациентов контрольгруппы (10 человек) материал забирали из внешне неизмененной кожи.Выделение моноклональных лимфоцитов из периферической крови (МЛПК)осуществляли по методу A.Boyum путем центрифугирования [185].