Диссертация (Аллерген туберкулезный рекомбинантный как скрининг-метод раннего выявления туберкулёза у детей и подростков при массовых профилактических осмотрах), страница 3

В 1939г. F.Seibert приготовилазначительную партию PPD туберкулина, которая использовалась в качествестандарта специфической активности. В дальнейшем эта серия была лиофильновысушена и предложена в качестве международного стандарта PPD; он былутвержден в 1952г. Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), какмеждународныйстандартсухогоочищенноготуберкулина.Зарубежом20применяется 2 вида туберкулинов, которые считаются эквивалентными - это 2единицы PPD RT23 (Дания), и 5 единиц PPD-S (США). В нашей странеприменяется сухой очищенный туберкулин, на основе полученного в 1939г.М.А.Линниковой- туберкулина PPD-L, представляющий собой фильтрат убитыхнагреванием культур Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis.

Более чемза столетнюю историю использования р.Манту накоплен огромный опыт, влитературе представлено множество исследований посвященных этой теме.Интенсивное развитие аллергологии, генетики, иммунологии, молекулярнойбиологии, генной инженерии позволило установить свойства туберкулина ирасшифроватьмеханизмреакцииМанту.Накопленыданныеонизкойинформативности реакции Манту. Показано, что на результат реакции могутвлиять аллергические проявления, кожные заболевания, профилактическиепрививки, перенесенные заболевания [6,78,122,123,175,176,181].Значительнуюнеопределённость в процесс диагностики туберкулёзной инфекции р.Мантувносят проявления поствакцинальной или неспецифической аллергии[89]. Этосвязано с содержанием в туберкулине полного набора микобактериальныхантигенов, всего туберкулин содержит 17 белков, встречающихся у микобактерийразличныхвидов.Из-затакогосоставатуберкулинасуществующаятуберкулинодиагностика р.Манту ограничена в своих возможностях.

Она нетолько обладает низкой специфичностью у вакцинированных детей, но и непозволяет отличить активную туберкулёзную инфекцию от перенесённого впрошломинфицирования[167,168,170].Туберкулиновыепробыявляютсяиммунологическими реакциями повышенной чувствительности замедленноготипа[202].

Для включения ответной реакции при туберкулёзе ключевым являетсядействие Т- хелпера. Дифференцировка т-хелперов контролируется цитокинами.Ключевыми цитокинами для ответа Th1 являются ИЛ-2 и интерферон ᵧ. Th1выполняют функции клеточного иммунитета, реализуемых специфическимимакрофагамии цитотоксическими лимфоцитами.Th2 вырабатывают комплексцитокинов , способствуют выработке IgE и реализации других проявленийреализации аллергических реакций.Th2 являются хелперами гуморального21иммунного ответа. Между Th1 и Th2 существуют отношения антогонизма. ДлятубинфицированныхлицболеехарактеренTh1профильцитокинов[41,95,96,97,98,99,100,111]. В общей популяции примерно у 10% детейс нормальным иммунитетом при активном туберкулезе реакция на пробу Мантуоказываетсяотрицательной[238,240,243].Изученачувствительностьктуберкулину при различных формах заболевания.

При сохранном иммунитететуберкулиновые пробы оказываются отрицательными в 17% случаев милиарноготуберкулеза и лишь в 3% случаев легочного туберкулеза [85]. Диагностическаязначимость туберкулиновых проб при ВИЧ-инфекции ограничена. Многие авторыуказывают,чтотуберкулиноваяинфицированныхВИЧпокожнаяпробасравнениюсменеечувствительнанеинфицированнымиуВИЧ[74,221,222,234,166]. Это связано со способностью ВИЧ вызывать нарушения виммунном статусе, в большей степени связанного с Т-лимфоцитами, чтоприводит к снижению ответной реакции на туберкулин.

Доказана зависимостьвыраженности реакции на туберкулин (10 ТЕ) от количества CD4Т- лимфоцитов:инфильтрат более 5 мм регистрировался у детей с содержанием CD4 клеток более500в мкл в 88,0% случаев, при числе CD4 клеток менее 400 в мкл - эта доля былазначительно меньшей. В литературе есть данные о исследованиях небольшихгрупп детей с ВИЧ-инфекцией и туберкулезом. Установлено, что среди них доляотрицательных реакций на туберкулин гораздо выше, чем при туберкулезе удетей без ВИЧ-инфекции [196,208,232,235,239,241,243].

Чувствительность ктуберкулину отрицательная у трети (35,2%) пациентов и зависит от степенииммунодефицита. При количестве CD4 - лимфоцитов менее 200 клеток/мкл(менее 15%) частота положительных реакций на туберкулин не превышает 13,4%,тогда как при CD4 более 500 клеток/мкл (более 25%) - сопоставима с таковой удетей без ВИЧ-инфекции (86,4%, 99,0%; p > 0,05) [81]. Впубликациях[165]приводятся данные по частоте положительных и отрицательных реакций на пробуМанту с 2 ТЕ (в том числе при туберкулезе), полученные при обследовании детей,рожденныхотженщин,больныхВИЧ-инфекцией.Выраженныеи22гиперергические реакции на туберкулин в этом случае выявляются в 15-33%,отрицательные - в пределах 15% случаев .Таким образом, накопленные данные о ограниченных диагностическихвозможностях р.Манту и её низкой специфичности стали толчком к поискуновых, более совершенных методов диагностики.231.2 Геном M. tuberculosis, специфичные антигены для диагностикитуберкулёзной инфекцииГеном M.

tuberculosis был расшифрован в 1998 году [201]. В научнойлитературе опубликованы результаты работ многих лабораторий, которыезанимались изучением антигенных отличий генома микобактерий. При сравнениигеномов М. bovis и M. bovis BCG [238] с геномом M. tuberculosisH37Rv иBCG[214,207] была определена генетическая зона RDI, которая присутствует вовсех штаммах М. tuberculosis и патогенных штаммах М. bovis, но отсутствует вовсех штаммах вакцины М. bovis BCG и большинстве микобактерий внешнейсреды.Вдальнейшемначалсяпоискидеальногобелка,подходящегодлядифференциальной диагностики. В экспериментальной модели кандидат видеальные белки должен был давать у зараженных М. tuberculosis животныхяркую реакцию, и не давать никакой реакции у вакцинированных БЦЖ.

Врезультате перебора «кандидатных» белков были выбраны самые подходящие.Белки ESAT6 и CFP10 кодируются в зоне RDI. В связи с отсутствием этихбелков в М. bovis BCG, они представляют особый интерес при разработкеспецифического диагностического теста, дифференцирующего инфекцию ивакцинацию BCG [220, 183, 213,205,206,223].

Были разработаны лабораторныетесты, использующие специфичные антигены М. tuberculosis - анализа продукцииIFN-y (IGRA) для диагностики туберкулёзной инфекции. В настоящее времяразрешены к коммерческому применению два варианта теста для диагностикилатентной туберкулезной инфекции. В обоих тестах используют болееспецифичные антигены М. tuberculosis ( ESAT-6, CFP- 10, и ТВ7.7.),тестыоснованы на применении Т-клеток,их продукции интерферона-ᵧ (IGRA -Interferon-Gamma Release Assays).Первый вариант - QuantiFERON (QFT), его поздние версии QuantiFERONTB Gold (QFT-G), QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-G1T), (Cellestis, Victoria,24Australia), использует твердофазный иммуносорбентный анализ для измеренияантиген-специфичной продукции интерферона-ᵧ (IFN-ᵧ) циркулирующими Тклетками в цельной крови[42].Второй вариант - T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Oxford, United Kingdom),использует технику Elispot для измерения количества мононуклеарных клетокпериферическойкрови,продуцирующихинтерферона-ᵧ(IFN-ᵧ).Егопредварительная версия - ELISPOT.В зарубежной литературе приводятся данные о том, что тесты IGRAобладают высокой чувствительностью и специфичностью [177,178,179,181,182,188,190,191,192,193,194,195,197,198,203,204,229,225].Порезультатамисследований ESAT-6, CFP-10 экспрессируются при размножении микобактерий.Тяжесть болезни, оцененная экспертизой патологии и бактериальным числом впораженных органах, соответствовала величине специфического ответа на ESAT6 [180,246,213].

Была отмечена корреляция между величиной ответа на этиантигены по выработке IFN-ᵧ и последующим развитием болезни. [230, 212, 215,228,185,224]. В работах Hill Р. et al., 2005 и М. Pai и соавторы (2006) [233]показано, что число клеток, продуцирующих IFN-ᵧ в ответ на ESAT-6,кореллировало с массивностью инфекции у контактов. Таких связей длятуберкулиновой пробы найдено не было.

Тесты IGRA более специфичны, чемкожный туберкулиновый тест в группах, в которых была проведена вакцинацияBCG[181]. Ряд исследователей указывают на вариабельность результатов IGRAпри обследовании одних и тех же людей[187, 244, 217, 210, 245]. В исследованиив Южной Африке[244] за 3 недели пациенту было проведено 4 теста QFT-GIT за 4недели, вариабельность ответов IFN-ᵧ составила 80%. В исследовании в Гамбии наздоровых волонтерах[184] анализ Elispot повторно проводили через неделю, у 12человек первоначально отрицательные результаты стали положительными, а из 11человек с положительной реакцией у 1 (что составило 9% от всех положительныхреакций) реакция стала отрицательной.В литературе мало работ о применении тестов IGRA у детей.

По даннымDosanjhD.иGolettiD.[219,216]отрицательныерезультатытестов-25туберкулиновых и IGRA - позволят с достоверностью 95,0% исключить наличиетуберкулезнойинфекции.ВработахМ.Pai[233,212]сравниваласьчувствительность, специфичность тестов IGRA по сравнению с туберкулиновойкожной пробой при диагностике латентной туберкулезной инфекции у здоровыхлиц и пациентов с иммуносупрессией, взрослых и детей.