Диссертация (Экспериментальное обоснование применения сложного биокомпозиционного материала с мезенхимальными стволовыми клетками для восстановления костных дефектов), страница 9

Методы гистологического исследования2.7.1. Гистологическая парафиномая проводкаОбразцы тканей фиксировали в нейтральном формалине в течение 24часа, после чего промывали в проточной воде и при необходимостидекальцинировали 12 часов в смеси соляной и муравьиной кислот, взятых вравных пропорциях. После промывки в проточной воде образцы проводилипо стандартной парафиновой проводке через этиловый спирт восходящихконцентраций до парафина.

Образцы тканей заливали в блоки иизготавливали полусерийные срезы толщиной 3-4 мкм. Срезы окрашивалигематоксилиномиэозином(BioLine,Италия)накаждыйФотодокументацию срезов проводили с использованием микроскопа LeicaDM1500 цифровой камерой EC3.2.7.2. Гистологическая метилметакрилатовая проводкаОбразцы фиксировали в этаноле 70% в течение 24 часов. После чегообезвоживали,пропитывалиметилметапкрилатом(OsteoBed,Sigma),полимеризовали.

Полученые блоки нарeзали на станке Isomet1000,шлифовали до толщины 25-35 мкм. Окрашивали небесным трихромом[ВолковА.В.,2016].Заключаливбальзамивысушивали.Фотодокументацию срезов проводили с использованием микроскопа LeicaDM1500 цифровой камерой EC3.57Глава 3. Результаты исследованийИсследование включало три этапа:I. На первом этапе проведена разработка полимерного каркасаматриксаизполи-3-оксибутирата(ПОБикомпозитаПОБ/ГА),исследование его in vitro на цитотоксичность и способность поддерживатьрост клеток и in vivo на мягкие ткани и бедренной кости крыс набиосовместимость.II.

На втором этапе были отработаны новые методики операции ипроведено экспериментальное исследование критических дефектов начерепах крыс с применением матриксов из ПОБ.III. На третьем этапе проведено экспериментальное исследованиекритических дефектов на черепах крыс с применением костного каркаса изПОБ совместно с МСК – тканеинженерной терапевтической системы.3.1. РезультатысозданиятканеинженернойтерапетическойсистемыПо методике двойного выщелачивания нами были полученытрехмерные скаффолды на основе ПОБ в количестве 30.

Из них 10 на основеПОБ заполненные альгинатом натрия, 10 на основе ПОБ/ГА, заполненныеальгинатом натрия и еще 10 на основе ПОБ/ГА, заполененные альгинатнымгидрогелем и МСК. Последние 10 матриксов представляет собойтканеинженерной терапевтической системы для регенерации костнойткани. На рисунке 18 представлено внешний вид матриксов.58Рисунок 18.

Внешний вид матриксов из ПОБ: А – до и Б – посленасыщения альгинатомТак как изготовленные матриксы тканеинженерной конструкциибыли использованны для ин витро исследования необходимо былообеспечит их стерильность. Для этого матрикс ПОБ/ГА стерилизовали вавтоклаве при 112 градусов С (30 мин, 1,5 атм.). Порошок альгината натрияперед получением геля стерилизовали ультрафиолетовыми лучами (длинаволны 253,7 нм). Насыщения матриксов альгината натрия и культивация наних МСК проводилось в стерильных условиях.Для введения МСК в биокомпозитные скаффолды, т.е. собственно дляизготовления тканеинженерной конструкции была использована культураМСК крыс. МСК были выделены из костного мозга 3-х дневных крысят.МСК культивировали в стандартных условиях [Жаркова, 2017]. Дляэксперимента использовали МСК 3-его пассажа [Bonartsev A.P., ZharkovaI.I., 2016].3.2.

Изучении структуры и морфологии скаффолдовПо методике двойного выщелачивания нами были полученытрехмерные матриксы из ПОБ (М = 130 кДа) (ПОБ) и его композита с ГА(ПОБ/ГА). Внешний вид матриксов из ПОБ до их заполнения альгинатнымгидрогелем и после представлен на рис. 18, но внешний вид матриксовПОБ/ГА практически такой же. На рис. 19 представлены фотографии59полученных матриксов до их заполнения альгинатным гидрогелем и после,полученныесиспользованиемметодаширокопольнойсветовоймикроскопии (СМ).

На этих фотографиях хорошо видна разница вморфологии, с одной стороны, матриксов, содержащих ГА, по сравнению сматриксами, не содержащими минеральный компонент, а, с другойстороны, матриксов, заполненных АЛГ, по сравнению с матриксами, незаполненными гидрогелем.АБВГРисунок 19.

Микрофотографии матриксов (А) – ПОБ, (Б) – ПОБ/АЛГ, (В) –ПОБ/ГА, (Г) – ПОБ/ГА/АЛГ, полученные методом широкопольной световоймикроскопии, ×100.Изучение образцов полимерных подложек методом сканирующейэлектронной микроскопии (СЭМ) (рис. 20) показало, что матриксы имеюттрехмерную пористую структуру с размером пор и пористостью, указанныхв таблице 4. Внутренняя структура матриксов гетерогенная: по своемуразмеру можно выявить макропоры и микропоры.

Макропоры больше 300мкм считаются оптимальным размером для проникновения питательных60веществ и клеток во всем объеме матрикса [Karageorgiou V., Kaplan D.,2005]. Заполнение матрикса альгинатом приводит к тому, что АЛГвыстилает внутреннюю поверхность пор матрикса, однако, следуетучитывать, что при приготовлении образцов для СЭМ происходитсублимация гидрогеля, что, разумеется, сильно искажает результатыисследования. Тем не менее, наличие биоматериала АЛГ довольно четковидно на внутренней поверхности пор матрикса – гладкая пленка закрываети выстилает его поры.АБРисунок 20. Микроструктура матриксов из ПОБ: А – до и Б – после заполненияальгинатом. Сканирующая электронная микроскопия, ×60.Таблица 4.Морфологическиехарактеристикиматриксанаосновеполи-3-оксибутиратаТип скэффолда Пористость, %С-ПОБС-ПОБ/ГА93 ± 192 ± 1Размер пор, мкмМакропорыМикропоры410 ± 7523 ± 8365 ± 6518 ± 7Связность пор++На рис.

21 представлены микрофотографии полученных матриксов:С-ПОБ и С-ПОБ/ГА, не содержащих АЛГ, в сравнении, полученные припомощи СЭМ. Как и в случае СМ на этих фотографиях хорошо виднаразница в морфологии скэффолдов, содержащих ГА, по сравнению соскэффолдами, не содержащими минеральный компонент.61АБРисунок 21. Микроструктура матриксов: А – ПОБ, Б – ПОБ/ГА, СЭМ, ×150.Однако, достоверной разницы в параметрах в морфологии матриксовне наблюдалось (табл. 4). В результате расчетов в среднем пористостьматриксов составила 92-93 %.

Размер макропор составил более 350 мкм, амикропор – около 20 мкм.Методом окрашивания чернилами определяли характер системы пор.В результате было доказано, что матриксы из ПОБ имеют сообщающуюсясистему пор.3.3. Исследование роста и дифференцировки МСК на скаффолдахсложной геометрической формыБыл исследован рост МСК на полученных матриксах ПОБ и ПОБ/ГА,не заполненных альгинатным гидрогелем.

Исследование роста МСК вматриксах с использованием теста на жизнеспособность ХТТ показало, чтонаблюдается слабый рост МСК в матриксах, который тормозится к 7 сут.Причем, достоверных отличий в росте МСК в матриксах из ПОБ икомпозита ПОБ/ГА не наблюдается, хотя и имеется некоторая тенденция кболее слабому росту клеток на матриксах из композита полимера с ГА(рисунок 22).62Рисунок 22. Рост МСК в матриксах ПОБ и ПОБ/ГА (относительнаяжизнеспособность клеток в % от количества первоначально внесенных на матриксклеток).Была проанализирована также цитотоксичность матриксов, т.е.

ихспособность подавлять рост клеток в стандартных условиях на пластикетакже с использованием теста на жизнеспособность ХТТ (рисунок 23).63Рисунок 23. Цитотоксичность матриксов ПОБ и ПОБ/ГА по отношению кМСК (относительная жизнеспособность клеток в % от количества клеток вконтроле на культуральном пластике)На рисунке видно, что в присутствии исследуемых образцовколичество клеток меняется незначительно по сравнению с контролем, чтоговорит об отсутствии цитотоксичности, хотя имеется тенденция кингибированию роста МСК на 1-е и 3-е сут. матриксами из композитаПОБ/ГА, но это изменение статистически недостоверно.На рисунок 24 представлены данные по изменению одного из главныхмаркеров остеогенной дифференцировки МСК – активности щелочнойфосфотазы в обычной ростовой среде для культивирования МСК в течение3-х недель.

Из представленной на рис. 20 диаграммы видно, что при ростеМСК на матриксах обоих типов наблюдается спонтанное возрастаниеактивности щелочной фосфатазы на сроках 2 и 3 недели. Причем,наибольшее увеличение активности фермента происходит в МСК,64культивируемых на матриксах из композита ПОБ/ГА, т.е. ГА значительнопотенциирует эту активизацию фермента.Рисунок 24. Активность щелочной фосфатазы скэффолдов ПОБ и ПОБ/ГАпри культивировании в них МСК в стандартной культуральной среде, * р<0,05достоверное отличие группы ПОБ/ГА от группы ПОБОстеогенная активность ГА хорошо известна [Chu T.M., 2002;Rodrigues C.V., 2003; Yoshikawa H., 2009; Guda T., 2012] и, вероятно, именноэтим объясняется гораздо большая активация щелочной фосфатазыматриксами ПОБ/ГА по сравнению с матриксами ПОБ.

Кроме того, повидимому, именно с активацией спонтанной дифференцировки МСК исвязан слабый рост этих клеток в матриксах, т.к. при дифференцировкистволовых клеток их пролиферация подавляется. Этим же можно объяснитьтенденцию ингибирования роста клеток при анализе цитотоксичностиматриксов из композита ПОБ/ГА. К сожалению, измерить активность65щелочной фосфатазы в МСК на матриксах, заполненных альгинатнымгидрогелем, было затруднительно из-за невозможности извлечения клетокиз гидрогеля.Таким образом, была разработана и получена тканеинженернаятерапевтическая система на основе матрикса из композита ПОБ/ГА,заполненная альгинатным гидрогелем, содержащим МСК. Полученнаясистема была использована для исследования ее терапевтическойэффективности на критическом дефекте костной ткани на лабораторныхкрысах in vivo.3.4.Терапевтическая эффективность полученной системы надефекте костной ткани на лабораторных животных in vivoИсследование проводили на 40 самцах крыс линии Wistar массой тела400 г., которые разпределили в 4 группах по 10 штук в зависимостиимплантированного в ним матрикса.ГруппаI–контрольнаягруппа,матриксневводиливсформированный дефект.Группа II – имплантация матрикса из ПОБ+АЛГ.Группа III – имплантация матрикса из ПОБ +АЛГ+ГА.Группа IV – имплантация матрикса из ПОБ +АЛГ+ГА +МСК.Образцы фиксировали в 70% этаноле в течение 24-72 часов.

Затемпромывали, обезвоживали и заливали в метилметакрилат (Osteo-Bead,Sigma-Aldrich) по стандартной методике, рекомендованной производителемс последующей полимеризацией. Получали пластиковые блоки, которыеперед изготовление срезов исследовали на конусно-лучевом компьютерномтомографе.Сканирование проводили в конусно-лучевом томографе Point 3DCombi 500 C, (Pointnix, Ю. Корея) на отработанном режиме 63kVp/7mA.Получены результаты компьютерной томографии черепов крыс позволили66измерить площадь регенерации дефектов исследуемых группах, учитываяплощадь первоначального костного дефекта 50,24мм2 (3,14*R(4мм)2).