Диссертация (Экспериментальное обоснование применения сложного биокомпозиционного материала с мезенхимальными стволовыми клетками для восстановления костных дефектов), страница 8

Однако, действие Золазепама гораздопродолжительнее действия его антагониста и для реверсии требуются46многократные повторные введения. Препарат является приоритетным дляиммобилизации и краткосрочной анестезии грызунов. Использованиеминимальной дозы обеспечивает иммобилизацию достаточную дляпроведения физикального обследования, взятия крови, рентгенографии имелких болезненных манипуляций. При этом у животного сохраненыкорнеальный,лингвальныйиглотательныйрефлексы.Реверсиянаблюдается через 40-80 минут после введения препарата. Для достиженияобщей анестезии используют более высокие дозировки. При наступлениихирургической стадии наркоза наблюдают отсутствие лингвального,гортанного и педального рефлекса.

Корнеальный рефлекс, как правило,сохранен. Применение Zoletil в этом случае позволяет проводить полостныеоперации, остеосинтез и т.д. В случае если операция длится более 40-60минут, может потребоваться повторное введение в среднем составляющее20% от первоначальной дозы. Реверсия обычно наступает через 1-3 часапосле последнего введения [Анестезия грызунов Гершов С.О. ВК «Кобра»2004].После наступелния анестезии произведен поперечный разрез кожи впаравертебральной области на спине крысь длинной 5 мм. Хирургическиминожницами отсепарована и мобилизована кожа, далее подкожно введенскэффольд из ПОБ (слева скаффолд ввиде цилиндра, а справа ввиде гранул).Затем рана ушита на глухо.После проведенных операций всем животным был введен антибиотикцефазолин (Sandoz, Австрия 25мг/кг) для профилактики инфекционновосполительного послеоперационного процесса (рис.

12,13).4712А. Эпиляция волос вобласти имплантации12В. Отслаивание имобилизация кожи12Б. Разрез длинной 5мм12Г. Имплантация матриксаиз ПОБ в виде трубочки12Д. Наложение швовРисунок (12). Схема этапов операции.4813А.Эпиляция волос вобласти имплантации13В. Отслаивание имобилизация кожи13Б. Разрез длинной 5мм13Г.

Имплантация матриксаиз ПОБ в виде гранул13Д. Наложение швовРисунок (13). Схема этапов операции.49Срок наблюдения составил соответственно протоколу 7, 14, 21 и 28дней. В указанные сроки проводили выводили животных, биопсиюисследуемойобласти.Материалотправлялинагистологическоеисследование.2.5.2. Исследованиебиосовместимостиразработанныхскаффолдах на бедренных костях крыс in vivoИсследование проводили на (28 штук) самцах крыс линии Wistarмассой тела 400г. Эксперимент соответствовал рекомендациям локальногобиоэтического комитета и этического комитета РУДН (Протокол № 10заседания биоэтической комиссии НижГМА от 07.04.2013; Протокол №8 от18.02.2016г),,приегопостановкеруководствовались«Правиламипроведения работ с использованием экспериментальных животных» всоответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г. и № 701 от24.07.1978 г. и «Правилами лабораторной практики в РоссийскойФедерации» от 2003 г.Под внутрибрюшинным наркозом «Золетил 100» (Virbac, Франция) вдозировке 125 мкг/кг крысам производили разрез кожи в бедренной областисправа над бедренной костью длинной 1 см.

Затем последовательно тупыми острым путём отсепаровывали мягкие ткани и скелетировали бедреннуюкость. Далее с использованием физиодеспенсера с помощью фиссурногобора формировали дефект кости длинной 5мм, шириной 2мм. Далее всформированный дефект вносили губчатый матрикс ПОБ из цилиндра. Самцилиндр из ПОБ разрезали вдоль, раскрывали и оборачивали им областьимплантации, создавая таким образом тканевой барьер. Рану послойноушивали (рис.14). Аналогично был произведен разрез и с левой стороны, гдеввели матрикс ПОБ ввиде гранул (рис.15).5014A. Эпиляция волос вобласти имплантации14В. Создание дефекта бедреннойкости14Д. Наложение швов14Б.

Разрез длинной 1см14Г. Имплантация матриксаиз ПОБ в виде трубочки14Е. Наложение швовРисунок (14). Схема этапов операции5115A. Эпиляция волос вобласти имплантации15В.Создание дефекта бедреннойкости15Б. Разрез длинной 1см15Г. Имплантация матриксаиз ПОБ в виде гранул15Е. Наложение швовРисунок (15). Схема этапов операции52Срок наблюдения составлял соответственно протоколу 28, 60 дней.

Вуказанные сроки выводили животных, взята биопсия исследуемой области.Материал отправляли на гистологическое исследование.2.5.3. Гистологическое исследованиеГистологическоеисследованиеобразцовтканивыполнялосьнепосредственно после биопсии. Материал помещали на 72 часа в 10%раствор формалина на фосфатном буфере, после чего в течение 24 часовобразцы ткани промывали в проточной воде. Затем после стандартнойпарафиновой проводки из кусочков изготавливались парафиновые срезытолщиной 3-5 мкм.

Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Послеокраски препараты заключали в монтирующую среду и высушивали втечение 2 недель при комнатной температуре.2.6. In vivo исследования на критическом костном дефектечерепах крысДля исследования регенерации костей черепа наиболее показательнойявляется модель критического дефекта свода черепа (теменной кости) укрысы [Spicer P.P., 2012; Бычков А.И., 2015], позволяющая получитьвоспроизводимые данные и сравнить их с многочисленными результатамидругих исследований [Kundu J., 2013; Gazhva J.V., 2014; Kuznetsova D.S.,2014; Ivanov S.Y., Bonartsev A.P., 2015]. Данную модель используют дляизучения эффективности и безопасности различных костезамещающихматериалов, в том числе матриксов с факторами роста и клетками [PellegriniG., 2009; Lee C.H., 2015; Васильев А.В., 2015; Chang-Hwan L., 2015].Все эксперименты соответствовали рекомендациям локальногобиоэтического комитета НижГМА и этического комитета РУДН (Протокол№ 10 заседания биоэтической комиссии НижГМА от 07.04.2013; Протокол№8 от 18.02.2016г), при его постановке руководствовались «Правилами53проведения работ с использованием экспериментальных животных» всоответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.

и № 701 от24.07.1978г.,«ПравиламилабораторнойпрактикивРоссийскойФедерации» от 2003 г. и ГОСТ ISO 10993-2-2011.Исследование проводили на 40 самцах крыс линии Wistar массой тела400 г., которые разпределили в 4 группах по 10 штук в зависимостиимплантированного в ним матрикса.ГруппаI–контрольнаягруппа,матриксневводиливсформированный дефектГруппа II – имплантация матрикса из ПОБ+АЛГГруппа III – имплантация матрикса из ПОБ +АЛГ+ГАГруппа IV – имплантация матрикса из ПОБ +АЛГ +ГА+МСКДля хирургических операций использовали внутрибрюшинныйнаркоз «Золетил 100» (Франция) в дозировке 125 мкг/кг.2.6.1. Методика операцииПод внутрибрюшинным наркозом «Золетил 100» (Virbac, Франция) вдозировке 125 мкг/кг крысам производили поперечный и вертикальныйлатерально-смещённый разрез кожи головы, формируя треугольный лоскути последовательно, тупым и острым путём обнажали теменные кости.Посередине сагиттального шва на теменных костях формировали круглоеотверстие с помощью трепана С-reamer диаметром 8 мм и высотой 1,5 ммиз набора Neobiotech SLA (Корея), избегая перфорации сагиттальноговенозного синуса.

Рану послойно ушивали. Поэтапно имплантацияматрикса изображена на рисунке 16,17.Рисунок 16. Схема этапов операции при создании критического дефекта натеменной кости крысы54Б.A.Г.В.Рисунок 17. Этапы операции: A – хирургический доступ Б – сформированкритический костный дефект, В – дефект закрыт костным матриксом; Г –подшивание костного матрикса к надкостнице2.6.2. Введение флюоресцентных меток для изучения скоростирегенерации костных дефектовМеханизм мечения костного регенерата основывается на связываниитетрациклиноподобных флуорохромов с ионами кальция с образованиемхелатных соединений, которые накапливаются в новообразованной костнойткани, что обеспечивает их последующую визуализацию. Для оценкидинамики неоостеогенеза на разных сроках проводили прижизненноетройноемечениеновообразованнойкостнойткани.Вовсехэкспериментальных группах крысам делали внутрибрюшинные инъекциираствора доксициклина к началу активной минерализации остеоида на 8-й,9-й и 10-й день после операции.

Затем на 15-й, 16-й и 17-й деньэксперимента крысам внутрибрюшинно вводили раствор тетрациулин,который, включаясь в новообразованную костную ткань, образует новуюмеченую область. На 22-й, 23-й и 24-й день – вводили ализарин красный С55для полного окрашивания краёв минерализованного регенерата. Меткивводили в дозировке 25 мг/кг массы тела. Таким образом, мечениеосуществляли по схеме 7-3-4-3-4-3-4 (три дня введения чередовались счетырехдневными перерывами).На 28-й день, что соответствовало окончанию процессов первичногоостеогенеза[BurrD.B.,2013],крысвыводилиизэкспериментапередозировкой наркоза Золетил/Рометар (Virbac, Франция / Bioveta,Чехия).

Скелетировали свод черепа, область регенерата выделяли сиспользованием хирургических цилиндрических боров и физиодиспенсера.Полученные образцы свода черепа фиксировали в 70% этиловом спирте втечение 24 часов. Такой способ фиксации широко употребляется длясохранения флуоресцентных меток и хорошей пропитки костной ткани[Yuehuei H., 2003].2.6.3.

Гистологическое и микроскопическое исследованиеОбразцы фиксировали в 70% этаноле в течение 24-72 часов. Затемпромывали, обезвоживали и заливали в метилметакрилат (Osteo-Bead,Sigma-Oldrich) по стандартной методике, рекомендованной производителемс последующей полимеризацией. Получали пластиковые блоки, которыеперед изготовление срезов исследовали на конусно-лучевом компьютерномтомографе.Такой метод был выбран так как пластик для фиксации нерентгеноконтрастен, а сами блоки легко позиционировать в полетомографа.Сканирование проводили в конусно-лучевом томографе Point 3DCombi 500 C, (Pointnix, Ю.

Корея) на отработанном режиме 63kVp/7mA.Из полученных блоков изготавливались первичные срезы 200 мкм(Lowspeed sow Jet, Швейцария), из которых готовились вторичные срезытолщиной 40-50 мкм. Контроль толщины среза осуществлялся стандартныммеханическим микрометром барабанного типа.Микроскопическое исследование проводилось с использованием56флуоресцентного микроскопа Leica DM 4000B. Микрофотографированиепроводилось с использованием стандартного набора светофильтром споследующимсложениемRGB-каналоввединоеизображениесиспользование штатного программного продукта Leica для флуоресцентноймикроскопии (мультиканальная гистопантомограмма).2.7.