Диссертация (Экспериментальное обоснование применения сложного биокомпозиционного материала с мезенхимальными стволовыми клетками для восстановления костных дефектов), страница 7

Затем готовили суспензию АЛГ с клеткамив концентрации 200 000 клеток в 1 мл суспензии (итоговая концентрацияальгинатасоставила1,0%).Полученнойсуспензиейспомощьюавтоматической пипетки пропитывали полученные на первой стадииматриксы ПОБ/ГА по 100 мкл (20 000 клеток) суспензии на один скаффолд.После пропитки удаляли лишний альгинат и заливали стерильным 50 мМраствором CaCl2 для полимеризации альгинатного гидрогеля, содержащегоклетки.

После инкубации в течение 3 минут в хлориде кальция, матриксыпромывали в фосфатном буфере и затем помещали в среду для дальнейшегоэксперимента.2.2. Методы изучения морфологии и пористости скаффолдовИсследование внешнего вида, морфологии и структуры полученныхматриксов проводилось с использованием сканирующей электронноймикроскопии (СЭМ) на JSM-6380LA (Япония) рис.9. Перед исследованиемобразцы закрепляли на алюминиевых столиках и напыляли золотом 15 минпри 15 мА (IB-3, Giko Engineering Co., Япония).Рисунок 9.

Сканирующий электронный микроскоп JSM-6380LA41ПористостьОпределение пористости матриксов проводилось с помощью методаопределения пористости через массу. Сначала была измерена массапористого матрикса (Acculab AL-64, USA), после чего измерены егодиаметр и высота, и посчитан теоритический объем монолитного матрикса,а через плотность полимера (1,25 г/см3) была рассчитана масса сплошногонепористого образца. Пористость рассчитывалась по формуле:П = (1 - m1/ m2) × 100%,где m1 – измеренная масса пористого образца, а m2 – расчетная массамонолитного образца без пор, объем которого совпадает с пористымобразцом.Наличие открытых пор проверяли методом окраски чернилами.Образец матрикса обмакивали в чернила, высушивали, после чегоразрезали.2.3.Исследование роста и активности щелочной фосфотазыМСК в скаффолдах сложной геометрической формыДля исследования роста МСК на биополимерных композитах ибиокомпозитных скаффолдах in vitro были использованы МСК крыс.

МСКбыли выделены из костного мозга 3-х дневных крысят. Клеткикультивировали в среде ДМЕМ в стандартных условиях согласнодиссертации Жаркова 2017 [Maniatopoulos C, 1988; Bonartsev A.P., ZharkovaI.I.,2017]. Все эксперименты были проведены согласно правилам гуманногообращения с лабораторными животными по ГОСТ ISO 10993-1-2011.Для исследования роста МСК in vitro в матриксах, не содержащихАЛГ, образцы сначала помещали в лунки 96-луночного планшета иклеточную суспензию наносили сверху на каждый образец из расчета 2000тысяч клеток в лунку. Для исследования роста МСК в матриксах,содержащих АЛГ, сначала готовили суспензию АЛГ соответствующей42концентрации с клетками в концентрации 200 000 клеток в 1 мл суспензии.Полученной суспензей с помощью автоматической пипетки пропитывалиматриксы на основе ПОБ и ПОБ/ГА из расчета 2000 клеток на один образецскаффолда для исследования.

После пропитки удаляли лишний альгинат изаливали стерильным 50 мМ раствором CaCl2 для полимеризацииальгинатного гидрогеля, содержащего клетки. После инкубации в течение 3минут в хлориде кальция, матриксы промывали в фосфатном буфере и затемпомещали в среду для дальнейшего эксперимента. Учет пролиферацииклеток исследовали с помощью метода ХТТ с использованием наборареактивов (Сигма-Алдрич, Германия). Данная методика основана на том,что живые клетки преобразуют соли тетразолия в окрашенные соединенияформазана. Её биохимические механизмы основаны на активностимитохондриальных ферментов, которые инактивируются вскоре послегибели клетки.

Этот подход оказался очень эффективным при оценкежизнеспособности клеток. Планшеты инкубировали 24, 72, и 120 ч. В случаетеста на цитотоксичность и 24, 72, 120 и 168 ч в случае теста набиосовместимость. По прошествии экспериментального времени в случаетеста на цитотоксичность, матриксы извлекали из лунок, а затем добавлялипо 50 мкл смеси ХТТ в каждую лунку; в случае же теста набиосовместимость матриксы переносили в лунки с 100 мкл свежей среды иинкубировали при 37 ºC в течение 2,5 ч, после чего матриксы извлекали излунок и растворяли SDS (натриевая соль лаурилсерной кислоты).Измерения проводили на планшетном спектрофотометре Zenyth 3100Microplate Multimode Detector (Anthos Labtec Instruments GmbH, Австрия)[Bonartsev A.P., Zharkova I.I., 2016; Kuznetsova E.S., Zharkova I.I., 2016;Bonartsev A.P., Zharkova I.I., 2017].Оценивали относительное количество прикрепленных клеток напервые сутки, а также увеличение их количества к 5 или 7 суткам.

Численновыражали через число клеточных делений, расчитаных по формуле:43n = lgN-lgN0 /lg2,где n - число клеточных делений, N- конечное количество клеток, N0изначальное количество. Количество клеток определяли по калибровочнойкривой. Затем рассчитывали относительное количество клеток в процентахот начального их количества, добавленного к образцу скаффолда [BonartsevA.P., Zharkova I.I., 2017].Былиполученыпредварительныерезультатыисследованияспонтанной дифференцировки МСК в матриксах in vitro с использованиемтестанаактивностьщелочнойфосфотазыкультивируемыхнабиокомпозитных скаффолдах МСК.Для определения щелочной фосфатазы использовали образцыматриксов ПОБ/АЛГ и ПОБ/ГА/АЛГ. Изначально МСК засевали из расчета20000 клеток на образец и анализировали на 7, 14 и 21 сутки.

Образцы, срастущими на них клетками, промывали 2 раза в ФБС (фосфатно-буфернойсистеме), затем помещались в лизирующий буфер (250мM NaCl, 0,1% TritonX-100, 50мМ Hepes, pH 7,5) и подвергали 3-м циклам замораживанияоттаивания. Затем образцы центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин иизмеряли показатели щелочной фосфатазы.В 96-луночную плашкудобавляли 100 мкл пробы и 50 мкл буфера (15 мМ н-нитрофенилфосфат(Sigma, США), 2 мМ Mg Cl, pH=10), инкубировали в термостате 60 минут иизмеряли оптическую плотность при 405 нм. Отрицательным контролемслужил лизирующий буфер, также в качестве контроля использоваликлетки, растущие на культуральном пластике [Bonartsev A.P., ZharkovaI.I.,2017].Анализ роста МСК на матриксах, цитотоксичность матриксов иактивность щелочной фосфотазы МСК были исследованы совместно сгруппой в.н.с.

Бонарцева А.П. кафедры биоинженерии Биологическогофакультета МГУ им. М.В. Ломоносова.442.4. Исследование цитотоксичности разработанных скаффолдовin vitroЦитотоксичностьопределяликолориметрическимтестомХТТ[Sutherland M. W., 1997; Лягоскин И.В.

2015; Куевда Е.В., 2017]. Дляисследования цитотоксичности использовали также МСК. Этот тестсодержит неокрашенную соль тетразолия, которая переходит в окрашеннуюсольформазанаприучастииферментныхкомплексовактивныхмитохондрий.Для исследования былаиспользована культураМикрофотографиякультурыклеток фибробластов COS-1 приувеличенииСтепень окрашивания прямо пропорциональна количеству активныхмитохондрий, т.е.

количеству живых клеток [Bonartsev A.P., Zharkova I.I.,2017].2.5. Исследование биосовместимости in vivoС целью определения биосовместимость разработанного намикостного скаффолда из ПОБ, были проведены экспериментальныеисследования на мягкие ткани и бедренной кости крыс породы Wistar.Животные закуплены за 3 недели до операции (18 штук), чтобы ониадаптировались к предстоящему эксперименту. Животные содержались ввиварии ЦНИИЛ НижГМА при 15 часовом световом дне при температуре+22С.

Пища и вода в постоянном доступе. К моменту эксперимента массаживотных составляла 400 мг. Содержание и работа с лабораторнымиживотными отвечала требованиям ГОСТ РИСО 10999.2.-2006, и проведенав соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных45животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей(Страсбург1986).2.5.1. Исследованиебиосовместимостиразработанныхскаффолдах на мягких тканях крысь in vivoДля эксперимента были подготовлены 2 вида скаффолдов: в видеполого цилиндра, заполненного гранулами и в виде гранул (рис. 10,11).Рисунок 10.

Полый цилиндр(трубочка) из полиоксибутиратазаполненная гранулами скаффолдаРисунок11.Скаффолдизполиоксибутирата в виде гранулОперации проводили под внутримышечным наркозом растворомZoletil 100 (Virbac, Франция, раствор). Zoletil – один из самых безопасныхпрепаратов для неингаляционной анестезии грызунов.

Он практически неугнетает дыхание и слабо влияет на сердечную деятельность, лишь внекоторых случаях, вызывая кратковременную тахикардию. Безопасностьэтого препарата подтверждается тем, что летальная доза (ЛД) Zoletil длягрызунов составляет 200 мг/кг, в то время, как доза для общей анестезииобычно не превышает 50 мг/кг. Таким образом, видно, что летальная доза в4 раза превышает средне терапевтическую дозу. Zoletil имеет оченьбольшую терапевтическую широту и, в зависимости от дозы, вызываетсостояние от слабой иммобилизации до глубокого наркотического сна.Недостатками этого препарата является отсутствие прямого антидота, хотяесть данные о применении Флумазенила для инактивации одного изкомпонентов – Золазепама.