Диссертация (Экспериментальное обоснование применения сложного биокомпозиционного материала с мезенхимальными стволовыми клетками для восстановления костных дефектов), страница 4

Альгинат, содержащий Р-трикальций фосфат, способенподдерживать рост и дифференцировку остеогенных клеток in vitro[Heywood H.K., 2004]. Тем не менее, к недостаткам альгината относят то,что данный полимер не обладает распознающими биологическимидоменами, в отличие, например, от коллагена (адгезивный пептид – RGD),что приводит к плохой адгезии клеток на его поверхность. Также свойстваальгинатных гидрогелей могут неконтролируемым образом изменятьсявследствие потери гелем ионных сшивок [Kim B.-S., 2000; Fialkov J.A.,2003].Поли-3-оксиалканоаты (ПОА).Полимеры β-оксимасляной кислоты – класс полиэфиров, которыепредставляютсобойвнутриклеточныерезервныесоединениявгетероцистах у цианобактерий [Vioque A., 2007]. Благодаря своей высокойбиосовместимости, наиболее известный представитель ПОА – поли-3оксибутират представляет весьма перспективный материал для тканевойинженерии [He Y.X., 2012].

В качестве подтверждения этого тезиса следуетпредставить следующие примеры клеточных культур, которые проявляютудовлетворительныйуровеньклеточнойадгезии,пролиферацииижизнеспособности при контакте с пленками или полимерными клеточнымикаркасами на основе ПОБ: мышечные и человеческие фибробласты [YangX., 2002; Ostwald J., 2003; Qu X.H., 2006], мезенхимальные стволовые клетки19[Wollenweber M., 2006], остеобласты костной ткани кролика [Wang Y.W.,2005], остеогенные клетки саркомы человека [Pompe T., 2007], хондроцитысуставного хряща кролика [Deng Y., 2003] и клетки гладкой мускулатурыкролика [Qu X.H., Liang J., 2006].

Дополнительно, для пленок ПОБ былопоказано, что фибробласты, эндотелиальные клетки и изолированныегепатоциты, посеянные на поверхность пленок ПОБ, проявляют высокийуровень клеточной адгезии и роста [Shishatskaya E.I., 2004].Высокаяжизнеспособностьипролиферациямакрофаговифибробластов отмечалась при их культивации в присутствии частицнизкомолекулярного ПОБ [Saad B., 1996]. Однако рост клеток на пленкахбыл относительно мал при клеточной плотности в интервале от 1×103 до2×105 [Yang X., 2002].

Вместе с тем, такие характеристики полимера какхимический состав, морфология поверхности, поверхностная энергия игидрофобность полимера оказывают большое влияние на жизнеспособностьклеток и их рост [Fischer D., 2003].Таким образом, ПОБ может быть использован в качестве клеточногокаркаса в условиях in vivo для контролируемой клеточной пролиферации[Bonartsev A.P., Zharkova I.I., 2016].В большинстве случаев получение каркасов из ПОБ для клеточнойинженерии основано на модификации поверхностных свойств этогобиополимера, что достигается, например, методом выщелачивания –вымывания предварительно введенной соли или обработки поверхностиферментами или химическими и физическими методами.

Роль поверхностинаиболее важна, прежде всего, потому, что ключевым фактором,определяющим использование биополимера в клеточной инженерии,является адгезия клеток, которая в свою очередь определяет клеточнуюфизиологию [Cochran D., 1994; Boyan B.D., 1996]. Наиболее эффективнымиметодами, повышающими клеточную адгезию к ПОБ и рост клеток наповерхности, являются обработка поверхности эстеразами, щелочью или20электрофизической плазменной обработкой. Например, обработка липазойувеличивает число здоровых клеток в 200 раз по сравнению снеобработанным образцом ПГБ.

Обработка щелочью (NaOH) усиливаетвыше указанный эффект в 25 раз. И обработка поверхности пленок ПОБ вплазме низкого давления в присутствии аммиака увеличивает ростфибробластов человека и эпителиальных клеток респираторной мукозы, какрезультат возрастания гидрофильности полимерной поверхности. Такимобразом,возрастаниегидрофильностиповерхностивследствиеферментативной обработки (липаза), щелочной обработки (NaOH) или, какэто было сказано выше, плазмой приводит к гидрофилизации поверхности,чтоупрощаетпротеканиеадгезииктакиммодифицированнымповерхностям. Морфология поверхности ПОБ существенно влияет наадгезию и рост клеток.

Причем, различные клетки предпочитают различныепо структуре поверхности. Так, остеобласты предпочитают развиваться нагрубых шероховатых поверхностях с подходящим размером углублений ипор [Boyan B.D., 1996], тогда как фибробласты предпочитают гладкиеповерхности, как и эпителиальные клетки, выбирающие для адгезиигладкие поверхности [Cochran D., 1994]. Подобная чувствительность клетокк размерам пор и шероховатости поверхности, по-видимому, связана сжизнедеятельностью клеток, с необходимостью газового обмена и обменаразличными веществами, т.е. с возможностью реализовать некоторыедиффузионные и гидродинамические условия подачи питательных веществдля клеток, а также с особенностями адсорбции белков [Deng Y., 2003; WangY.W., 2005].

Пленки ПОБ, приводимые в контакт с кровью, не активируют(не смещают) гемостаз системы на клеточном уровне, но могутактивироватьсистемукоагуляциииреакциюкомплемента,т.е.воздействовать на молекулярном уровне [Бонарцев А.П., 2011].Поли-3-оксибутират-ко-3-оксигексаноатестественнымбиологическимполиэфирным(ПОБГк)являетсяматериалом,который21принадлежит к семейству ПОА [Wang Y.W., 2004].

Наряду с другимихорошо известными полимерами из группы ПОА, поли-3-оксибутиратом(ПОБ) и поли-3-оксибутират-ко-3-оксивалератом (ПОБВ), ПОБГк имеетхорошую способность к биологическому разложению. ПОБГк обладаетхорошей биосовместимостью с различными типами клеток, в том числе склеткамигладкоймускулатуры,фибробластами,полученнымиизсуставных хрящей хондроцитами, остеобластами, а также клеткамикостного мозга [Wang Y., 2012].ИзделияизПОА,какправило,биоразлагаемыеитермообрабатываемые и поэтому получили широкое применение как втрадиционных медицинских приборах, так и в тканевой инженерии. Из-засвоей хорошей биосовместимости, ПОА все чаще используются какбиоматериалы клеточных каркасов для тканевой инженерии.

Ye C. и др. [YeC., 2009] показали, что трехмерный каркас ПОБ/ПОБГк, засеянныйдифференцированными стволовыми клетками человека из жировой ткани,способен производить хрящевые ткани после имплантации в подкожныйслой голых мышей. Каркасы из ПОБ/ПОБГк были успешно применены вестественных условиях модели восстановления сухожилия, о чемсвидетельствует облегчение восстановления движения сухожилия иполного восстановления функций у крыс-реципиентов [Webb W.R., 2013].Тем не менее, он весьма хрупкий и разлагается медленно, и оба эти свойстваограничивают его практическое применение. Другой член группы ПОА,ПОБВ может быть получен в виде волокон, которые способствуютреэпителизации.

После модификации поверхности, ПОБ и ПОБВ могутспособствовать остеоинтеграции [Kose GT., 2003].Синтетические полимеры:Полигликолид – представляет собой высоко кристаллический полимер(45-55%) с большим пределом прочности по растяжению [Zhu G.C., 2015].Гликолид мономер, который используют в реакции полимеризации,22синтезируется путем димеризации гликолевой кислоты. Из-за своегобольшого предела прочности полигликолид впервые был отмечен какрассасывающийся, синтетический шовный материал [Pihlajamäki H., 2007;Bremer F., 2009; Cartmill B.T., 2014]. Полигликолид также является однимиз наиболее прочных синтетических биоматериалов, с модулем упругостипри растяжении 12,5 ГПа. По этой причине, полигликолид также былисследован в качестве материала ортопедической фиксации перелома(Biofix). Полигликолид также был использован в качестве покрытия швовдля увеличения их биосовместимости и доставки антибиотиков в областизакрытой раны [Ford H.R., 2005; Ming X., 2007].Полилактид подобно гликолиду образуется путем димеризациимолочной кислоты.

Полилактид представляет собой полимер с 35%кристалличности и модулем Юнга 4.8 ГПа, что делает его значительно болеегибким, чем полигликолид. Из-за гидролиза сложного эфира основной цепи,полилактид теряет большую часть своей силы через 6 месяцев вестественных условиях. Подобно полигликолиду, полилактид подвергаетсяв организме биодеградации с образованием в качестве конечного продуктамолочной кислоты – компонента клеточного метаболизма. Полилактидвыступает в качестве исходного материала для печати в 3D-принтерах [GuoS.Z., 2014]. Имплантаты из полилактида в основном применяются вортопедии из-за высокого модуля Юнга этого полимера и его способностивыдерживать большие механические нагрузки, в частности, при сжатии.Клинически доступные ортопедические имплантаты из полилактида;штифты, винты и другие фиксирующие устройства.

Мембраны изполилактида также использовались для усиления заживления критическихдефектов кости [Meinig R.P., 2009].Керамика и биоактивное стекло. Благодаря своим механическим иструктурным особенностям керамика играет важную роль в тканевойинженерии кости. Многие керамические материалы не резорбируются,23однако это является положительным свойством в замещении большихкостных дефектов, которые заживают более длительно. В этом случаекаркас служит основной структурной поддержкой для поврежденныхтканей, позволяя интеграцию клеток-хозяев. Некоторые виды керамики,такие как трикальций фосфат и кальций карбонат могут разлагаться вестественных условиях. Их применяют при лечении небольших костныхдефектов.Несмотря на то, что биоактивное стекло уступает керамическимматериалам по своей структуре, оно служит важным компонентом винтеграции каркаса. Биоактивное стекло в основном используется всочетаниискерамическимиматериаламииз-заихспособностистимулирования сцепление тканей в естественных условиях.

Биоактивноестекло может инициировать покрытие его поверхности гидроксикарбонатапатитом. Этот слой структурно похож с минеральным гидроксиапатитом,найденным в кости, и сцепление между материалами позволяет каркасинтегрироваться в костной ткани [Rezwan K., 2006; Попков А.В., 2014].Большое количество приспособлений из керамики и биоактивногостекла было одобрено для клинического использования. Керамическиетазобедренныеопорыиприспособлениядляфиксацииобычноиспользуются в эндопротезировании тазобедренного сустава [Jeffers J.R.,2012; Кирилова И.А., 2013]. Имплантаты из корундовой керамики былииспользованыубольныхспосттравматическимидефектамиидеформациями лицевого скелета [Чернегов В.В., 2005].

Керамические смеситакже используются в позвоночных замещениях у пациентов с опухольюспинного мозга [Hosono N., 1995]. Биоактивное стекло и полиуретан такжеприменяется при замещениях тела позвонка [Schulte M., 2000].241.3.Костные морфогенетические протеины и фактор ростаэндотелия сосудовВ настоящее время известно несколько протеиновых молекул,способныхсущественнымобразоммоделироватьпроцесскостнойрегенерации. Например, такие факторы, как семейство КМП – костныеморфогенетические протеины (англ.

BMP, bone morphogenetic protein) иФРЭС – фактор роста эндотелия сосудов (англ. VEGF, Vascular endothelialgrowth factor).ВсовременнойнаучнойлитературеКМП(костныеморфогенетические протеины) представляют собой одно из суперсемействТРФ-βиимеютнемаловажнуюрольврегулированиироста,дифференцирования и апоптоза различных типов клеток включаяостеобласты, хондробласты, нервные и эпителиальные клетки [Reddi A.H.,2000; Dimitriou R., 2005; Devescovi V., 2008; Hollinger J.O., 2008]. Внастоящее время индентифицирано 20 гомо- или гетеродимерныхструктурно связанных протеинов, которые очень схожи друг с другом иимеются у многих животных включая человека [Wozney J.M., 1999].Наиболее изученными и нашедшими применение в клинической практикеявляются ВМР 2 и 7 [Devescovi V., 2008; Hustedt J.W., 2013; Carlos delRosario, 2015]Интенсивно проводимые исследования по изучению молекулярных иклеточных механизмов костеобразования показывают, что в процессеостеогенеза в месте перелома принимают участие различные ростовыефакторы (цитокины), которые влияют друг на друга, взаимодействуют снесколькими типами клеток и, возможно, КМП являются среди нихнаиболее важными и активными остеоиндукторами.