Автореферат (Иммуноморфология селезенки при действии гомо- и гетеротипических стрессоров на разных этапах онтогенеза), страница 2

Методы математической обработкиполученных результатов соответствуют поставленным задачам.Материалыдиссертациидокладывалиськонференциях студентов и молодых ученыхнаитоговыхнаучныхФГБОУ ВО " Волгоградскийгосударственный медицинский университет" Минздрава России, представлены вматериалах зарубежных конференций.Личный вклад автора в проведенное исследование:Научные результаты, обобщенные в диссертационной работе, полученыавторомсамостоятельно.Авторомличнопроведеныморфологические,гистохимические и морфометрические исследования, выполнены статистическаяобработка, анализ и трактовка полученных результатов, сформулированы выводыи практические рекомендации, подготовлены научные публикации и доклады.Соответствие диссертации паспорту научной специальностиНаучные положения диссертации отвечают паспорту специальности 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистологияПубликации по теме работы.

По материалам диссертации опубликовано12 научных работ, из них - 4 (2 – оригинальные и 2 – обзорные) в изданиях,8входящих в Перечень рецензируемых научных изданий, в которых должны бытьопубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученойстепени кандидата наукОбъем и структура работыДиссертация изложена на 103 страницах машинописного текста и состоитиз введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,собственных результатов, их обсуждения, выводов, заключения и спискалитературы, включающего67российских и 110 зарубежных источников.Работа иллюстрирована 9 рисунками.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМетодологияиметодыисследования.Методологическиработапостроена на принципах системного анализа комплекса данных.

Для решенияпоставленныхзадачбылиспользованкомплекссовременныхметодовисследования - иммуногистохимический метод исследования и имидж-анализа.Исследования проведены с согласия Комитета по этике при ФГАОУ ВО ПервыйМосковскийгосударственныймедицинскийуниверситетим.СеченоваМинздрава России (Сеченовский университет)Исследование выполнено на 48 крысах породы Спрег-Доули в возрасте 20и 45 суток, что соответствовало инфантильному и перипубертатному периодампостнатального развития. На момент окончания эксперимента возраст был 28 и53 суток соответственно.

В каждой возрастной группе, включающей 24 особи,животных подразделяли на 3 подгруппы: контрольную и 2 экспериментальныедля моделированияхронического гомотипического и гетеротипическогострессов.В качестве гомотипического стрессорного воздействия применялся стресс«избеганияводы»,авкачествегетеротипического—использоваласьнепредсказуемая последовательность действия трех стрессоров: «избегания9воды», «водной иммерсии» и иммобилизации при температуре 4 °С.

Животныхсодержали в стандартных условиях вивария при температуре +20°С с доступом кводе и пище ad libitum. Экспериментальных животных ежедневно на протяжении9 суток по 2 часа в день, начиная с 9 часов утра, подвергали стрессорномувоздействию, в то время как животные групп возрастного контроля находилисьвне аудио- и видео-досягаемости от экспериментальных животных. Послепоследнего сеанса стресса животных под анестезией декапитировали, селезенкуизвлекали, фиксировали формалином и заливали в парафин.Гистологические срезы селезенки окрашивали гематоксилином-эозином ииммуногистохимически поликлональными антителами к белку S100 (Дако,Дания, Z0311) – маркеру стромальных клеток, а также моноклональнымиантителами к PCNA (клон PC 10 - ядерного антигена пролиферирующих клеток,AbDSerotec, США, MCA 1558); CD4 (клон W3/25) - маркеру Т-хелперов итимоцитов (AbDSerotec, США, МСА55); CD8 (клон MRC ОХ8) - маркерутимоцитов, Т-клеток и NK-клеток (AbDSerotec, США, МСА48), CD90 (клонHIS51) - маркеру тимоцитов, недавних тимусных иммигрантов (BD Biosciences,//550570), каспазы-3 - маркеру апоптоза (AbDSerotec, США, Z/AHP476), 0X62(клон MRC 0X62) - маркеру стромальных клеток (AbDSerotec, США, MCA 1029);CD20 (клон R1N- 9D3) - маркеру пре- и зрелых В-лифмоцитов (AbDSerotec, МСА1432).Для визуализации применяли стрептавидин-биотин - пероксидазный методпо стандартным методикам в соответствии с рекомендациями производителейреактивов.Удельныеплощадииммунопозитивныхклеток,окрашенныхдиаминобензидином в коричневый цвет, оценивали морфометрически сприменениемпрограммыImage-Pro+8.0(MediaCybernetics,США),транспортирующей цифровые данные в программу Excel.Определяли среднюю арифметическую величину, среднеквадратическоеотклонение,ошибкурепрезентативности.Оценкузначимостиразличийсравниваемых величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента.Критическим уровнем значимости считали р<0,05.10РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕИмиджанализ селезенкикрыс разных возрастных групппривоздействии гомо- и гетеротипического стрессаХронический стресс при действии как гомо-, так и гетеротипическихстрессоров вызывал микроскопические изменения в селезенке.

Они заключалисьв уменьшении объема Т- и В-зон белой пульпы, маргинальной зоны вокруг них,снижении плотности расположения клеток как в Т-зонах (периартериальныелимфоидные влагалища), так и в В-зонах (лимфоидные узелки), а такжеувеличении в них количества макрофагов с неокрашенной цитоплазмой,захвативших апоптозные тельца.В селезенке контрольных животных CD8 клетки были расположеныравномерно,свысокойплотностьювпериартериальныхлимфоидныхвлагалищах, которая была несколько выше у животных перипубертатнойвозрастной группы; значительно меньшее их количество определялось вмаргинальной зоне, в лимфоидных узелках они отсутствовали.После воздействия обоих видов стресса их доля в периартериальныхлимфоидных влагалищах резко уменьшилась у экспериментальных животных вобеих возрастных группах, что сопровождалось общим уменьшением объема Тзонселезенки.ЭтиизмененияболеевыраженывТ-зонахживотныхинфантильного возраста.CD90-позитивные клетки концентрировались в основномв Т-зонах,единичные клетки встречались в селезеночных тяжах.

После воздействия стрессаони практически исчезли из белой пульпы, особенно у животных инфантильнойгруппы. Снижение числа СD90+клеток зависело от вида стресса:послегомотипического стресса в наружной зоне крупных ПАЛВ оставалось умеренноеколичество клеток, в то время как пригетеротипическом стрессе у крысинфантильного возраста лишь единичные клетки определялись в мелких ПАЛВ иселезеночных тяжах.Полученные данные морфометрического анализа отражены в рис.

1.11Рисунок 1. Изменения микроморфологической картины селезенкиконтрольных и экспериментальных животных после воздействиягомотипического и гетеротипического стресса.Селезенка крыс перипубертатной (а-г, ж, з) и инфантильной (д, е) возрастных групп вконтроле (а, в, д, ж) и после гомотипического (б) и гетеротипического (г, е, з) стресса.а, б –реакция на СD8+, в, г- реакция на CD90+, д, е - реакция на OX62+, ж, з - реакция на PCNA12При окрашивание на СD20 отмечалосьяркое окрашивание и высокаяплотность клеток в лимфоидных узелках, и несколько меньшая в маргинальнойзоне . Гетеротипический стресс вызвалопустошение лимфоидных узелковселезенки из-за резкого снижения в них числа СD20-позитивных клеток; вменьшей степени изменения захватывали маргинальную зону селезенки, а такжеселезеночные тяжи у животных обеих возрастных подгрупп.Окрашивание на белок S100 показало, что после стрессорного воздействиясеть стромальных клеток лимфоидных узелков селезенки, оказалась почтиполностью разрушенной, особенно выраженными эти изменения были привоздействии гетеротипического стресса у животных исходного инфантильноговозраста.

Каспаза-3-иммунореактивные клетки содержались больше в В-зонах,чемв Т-компартментах, и увеличение их доли было заметно выше пригетеротипическом стрессе у животных перипубертатнойгруппы.экcпериментальнойПри окраске на PCNA доля иммунореактивных клеток в ПАЛВумеренно уменьшилась в инфантильной группеперипубертатнойэкспериментальнойгруппе.и резкоВснизилась влимфоидныхузелкахуменьшение доли иммунореактивных клеток ассоциировалось с их разрушениемдо полного исчезновения.Дляобъективизациинаблюденийбылпроведенцифровойанализизменений в селезенке, позволивший выявить наиболее информативные критерииоценки постстрессовой динамики различных клеточных популяций. Результатыморфометрии получены при обработке срезов селезенки, где значительнаяплощадь среза позволяла с помощью заданного шага произвольно выделятьтребуемых 5 полей зрения для имидж-анализа.УдельнаяконтрольныхплощадькрысCD4+иммунореактивныхинфантильноговозрастаклетоксоставилавселезенке16.25±1.47%,перипубертатного возраста - 18.34± 1.62 %.

В экспериментальной группе послевоздействиягомотипическогоCD4+иммунореактивных клеток у крысстрессаудельнаяплощадьинфантильного возраста составила11.09± 1.18%, что достоверно отличалось от показателей контрольных крыс13соответствующего возраста (p < 0,01). У животных перипубертатного возрастадинамика была менее выражена, но также статистически значима, содержаниеCD4+иммунореактивных клеток снизилось до 13.09±1.44% (p < 0,05). Послевоздействия гетеротипического стрессора изменения исследуемых параметровпо сравнению с контрольной группой оказались еще более выраженными,особенно у экспериментальных крыс инфантильного возраста. Установленозначительное уменьшение долиCD4+иммунореактивных клеток у крыс обеихвозрастных групп , которая составила 9.76±1.14% и 11.91± 1.21% соответственно(p < 0,01) (рис.

2)Рисунок 2. Удельная площадь CD4+ иммунореактивных клеток вселезенке контрольных и экспериментальных животных (¯x±S¯x)По горизонтальной оси: I – инфантильный возраст; II – перипубертатный возраст;исследованный показатель (%). Различия по сравнению с контролем значимы: * при Р < 0,05;** при Р < 0,01;. Вертикальные отрезки – значения стандартной ошибки.Изучениевоздействиягомо-игетеротипическихстрессоровнаCD8+иммунореактивные клетки в селезенке контрольных и экспериментальныхкрыс продемонстрировало похожие тенденции. Удельная площадь, занимаемаяCD8+иммунореактивнымиклетамивселезенкеконтрольныхкрысинфантильного и перипубертатного возраста составила 19.98± 1.67 % и 19.98±1.67%соответственно.