Автореферат (Разработка способа получения субстанции антимикробного действия на основе ройлеанонов из корней шалфея лекарственного), страница 4

Различие заключается в параметрах сигнала Н-18: в 1Н ЯМР спектре: дублетный характер(2,2 м.д.) указывает на отсутствие ОН-группы при С-19.Принадлежность нового вещества XI к пентациклическим тритерпенам с Δ12 следует изданных масс-спектра, фиксирующего ретродиеновый распад: характеристические пики m/z 486,m/z 248 (циклы D, E), m/z 223 (циклы А, В), m/z 219, m/z 203 (m/z 248-СООН).Принадлежность вещества XI к производным β-амирина следует из параметров сигналаН-18: дублет дублетов 2,84 м.д., J1=13,6 Гц, J2=4,5 Гц. Мультиплетность сигнала Н-3 (дублет 3,0716м.д., J=9,6 Гц) указывает на наличие второй кислородной функции при С-2. Значение КССВ всигнале Н-2 (секстет, 3,79 м.д., J1=11,4 Гц, J2=9,6 Гц, J3=4,3 Гц) свидетельствует о 2α, 3βконфигурации ОН-групп при С-2 и С-3, подобно торментоловой кислоте. Дублеты 4,05 м.д.

и3,35 м.д., КССВ 11,2 Гц, в 1Н ЯМР спектре обусловлены транс-диаксиальными протонамиизолированной группировки –СНОН-СНОН- (Рисунок 10). Такая группировка может быть вцикле Е: С(21)НОН-С(22)НОН или в цикле D: С(15)НОН-С(16)НОН. Выбор в пользу первоговарианта сделан на основе близости химических сдвигов СН3-27 XI и торментоловой кислоты(1,58 и 1,65 м.д. соответственно). При наличии ОН- при С-15 и С-16 этот сигнал лежит в области1,78-1,85 м.д.Рисунок 10 – Спектр Н, Н СOSY вещества XI в CD3ODВ лаборатории микробиологических исследований было проведено изучениебактериостатической и фунгистатической активности олеаноловой и урсоловой кислот.Установлено, что урсоловая и олеаноловая кислоты обладают бактериостатической активностьюв отношении золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus 209-P) в концентрации 125-250мкг/мл и в отношении грамотрицательных синегнойных бактерий (Pseudomonas aeruginosaАТСС 9027) в концентрации 1000 мкг/мл.

Активность в отношении грамотрицательныхмикроорганизмов весьма ценна, т.к. очень немногие природные соединения и антимикробныепрепараты ею обладают. Таким образом в субстанции антимикробного действия Ройлевинотмеченаоднонаправленнаяактивностьмеждуосновнымантимикробнымначалом(ройлеанонами) и сопутствующими тритерпеновыми кислотами.3.

Разработка способа получения субстанции антимикробного действия РойлевинНами был разработан способ получения субстанции антимикробного действия из корнейшалфея лекарственного на принципиально иной технологической основе по сравнению с17«Донелвином». В качестве антимикробного начала присутствует индивидуальное соединение –горминон. Сырье экстрагируют 96% этанолом, после отгонки растворителя кубовый остатокразбавляют водой, обрабатывают хлороформом, целевой продукт экстрагируют из хлороформаводной щелочью, подкисляют соляной или серной кислотой.

Экстракцией целевого продукта изхлороформа щелочью в виде фенолята, растворимого в воде, решаются сразу две задачи –гидролиз менее активного 7-ацетоксигорминона и отделение от горминона примесей липидногохарактера.Введение в схему щелочного агента (1% водный раствор гидроксида натрия) требовалодоказательства стабильности целевого продукта в щелочной среде. С этой целью был записан 1НЯМР спектр горминона, обработанного 1% раствором гидроксида натрия в дейтерометаноле(CD3OD) через 20 минут после растворения, через 6 часов и 24 часа.Изменений в спектрах не наблюдалось (Рисунок 11), что указывает на стабильностьгорминона в щелочной среде в течение по крайней мере 24 часов и о возможностижидкофазной экстракции в течение такого времени.Рисунок 11 – 1Н ЯМР спектры горминона в 1% растворе NaOH через 20 минут (верх)после растворения и через 24 часа (низ)Отсутствие конкурирующих реакций в ходе щелочного гидролиза ацетилгорминонадоказывали следующим образом: 20 мг ацетилгорминона растворили в 5 мл 1% раствора NaOHв D2O.

Отбирали пробы по 1 мл раствора через 6, 11, 16, 23 и 270 минут после растворения,подкисляли 5% раствором HCl до нейтральной реакции, извлекали реакционную смесьдейтерохлороформом, удаляли водную фазу и записывали 1Н ЯМР спектр хлороформногораствора. В 1Н ЯМР спектрах присутствуют сигналы только исходного 7-ацетилгорминона (Н-75,8 м.д., мультиплет) и продукта реакции – горминона (Н-7 4,75 м.д., мультиплет). Отсутствуютдублеты дублетов в ароматической области (6,5-6,8 м.д., олефиновые протоны 6,7дегидроройлеанона) (Рисунок 12).

Следовательно, возможная побочная реакция дегидратациипри элиминировании ацетоксигруппы не имеет места.18Рисунок 12 – 1Н ЯМР спектры (фрагменты, содержащие Н-7 ацетилгорминона игорминона) через 6 мин и 23 мин после начала реакции соответственноВ результате описанных экспериментов моделирования реакции гидролиза ацетилгорминонаи способности горминона сохранять стабильность в течение 24 часов показана возможностьиспользования этой реакции в технологии получения субстанции антимикробного действия Ройлевин.На головной стадии экстракции сырья 96% этанолом оптимальными параметрами являютсясоотношение массы сырья и объема экстрагента 1:5, кратность процесса – 3 экстракции, время 1й, 2й,3й экстракций соответственно 4, 3, 2 часа, размер частиц измельченного сырья ≤ 3 мм.

На стадиижидкофазной экстракции оптимальными параметрами являются трехкратная экстракция водной фазыхлороформом, четырехкратная экстракция целевого продукта водной щелочью из хлороформа ссодержанием гидроксида натрия 1%. Результаты разработки лабораторного регламента получениясубстанции антимикробного действия Ройлевин проведены на 3х сериях и представлены на Рисунке13.4. Разработка показателей качества субстанции антимикробного действия РойлевинСубстанция антимикробного действия представляет собой аморфный порошок сероватожелтого цвета без запаха, не растворимого в воде, растворимого в 96% этаноле и хлороформе.Подлинность субстанции устанавливается с помощью качественной реакции в растворе сгидроксидом натрия или аммиаком (фиолетовое окрашивание), ТСХ (окрашивание зоны адсорбциипарами аммиака в розово-фиолетовый цвет) (горминон), ВЭЖХ (наличие пика с временемудерживания горминона 44 мин и отсутствие пика с временем удерживания ацетоксигорминона(Рисунок 14)), 1Н ЯМР (характеристические сигналы: 4,72 м.д., мультиплет, Н-7; 3,12 м.д., септет, СН-(СН3)2; 2,65 и 2,75 м.д., мультиплет, Н-1, УФ-спектроскопия (в 96% этаноле максимумпоглощения 273 нм).19Спирт этиловый96%ТП1ИзмельчениерастительногосырьяПотерина выбросТП2.1Шрот с ТП 2.1Экстракциясырья, слив ифильтрацияэкстрактав сборникна выбросТП2ТП2.2ТП2.3ТП2.4ТП2.5Упариваниеспиртовогоэкстракта,добавлениеводы,подкислениеОтфильтрованныечастицы сырья с ТП2.1в сборникна выбросВР1Экстракцияройлеанонов изхлороформнойфракции воднойщелочью.ГидролизройлеаноновТП2.6Сушка иизмельчениепродуктаТП2.7УпариваниехлороформнойфракцииОтгон спиртас ТП 2.4на ТП 2.1ЭкстракцияводнойфракциихлороформомПодкислениещелочногораствора,отфильтровывание осадкаройлевина,промывка водойПолучениеготовогопродуктаПриготовление 1%водного растворагидроксида натрияОтгонхлороформас ТП 2.7на ТП 2.3ВР2УМО3Приготовление 5%водного растворасоляной кислотыФасовка,упаковка,маркировкаройлевинаОтработанная воднаяфракция послеэкстракциихлороформом с ТП 2.3в сборникна выбросБалластныевещества изхлороформнойфракции послеТП 2.7в сборникна выбросПотерив сборникна выбросМаточник ипромывные водыпосле отделенияройлевина с ТП2.5в канализациюпосленейтрализациикислотыРисунок 13 – Технологическая схема получения Ройлевина2044,051Рисунок 14 – ВЭЖХ-хроматограмма Ройлевина5.

Разработка методики количественного определения горминона в РойлевинеКоличественное определение горминона в субстанции Ройлевин проводится прямойспектрофотометрией с использованием удельного показателя поглощения СО горминона.Методика проведения анализа: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 0,02 гсубстанции Ройлевина, прибавляют 10 мл спирта этилового 96%, перемешивают дополного растворения и доводят до метки этим же растворителем (раствор А). Затем вмерную колбу вместимостью 25 мл приливают 1 мл раствора А и доводят до метки спиртомэтиловым 96% (раствор Б).Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре в кювете с толщинойслоя 10 мм при длине волны 273 нм. В качестве раствора сравнения используют спиртэтиловый 96%.Содержание горминона в процентах в пересчете на абсолютно сухую субстанциюРойлевина рассчитывают по формуле:Х =D ⋅ 25 ⋅ 25 ⋅ 100%m ⋅ 1 ⋅ A11см⋅ (100 − W ) , гдеD – оптическая плотность испытуемого раствора;1%А1см- удельный показатель поглощения СО горминона 395;m – масса Ройлевина, взятого на анализ, г;21W – потеря в массе при высушивании Ройлевина %.Содержание горминона в Ройлевине устанавливается не ниже 35%.ГорминонСОполучаютследующимобразом:субстанциюРойлевинхроматографируют на колонке с силикагелем, отбирая фракции, содержащие толькогорминон (контроль визуально и с помощью ТСХ).

Элюат упаривают, технический продукткристаллизуютиз90оэтанола.Принеобходимостиделаютдополнительнуюперекристаллизацию. Для определения подлинности и чистоты предлагаются качественнаяреакция в растворе, 1Н ЯМР спектр, УФ-спектр (λmax=273±2 нм), ВЭЖХ хроматограмма,удельный показатель поглощения 395, т. пл. 178-181 оС с интервалом 1-2 оС. В качествепримеси к горминону может быть его эпимер по С-7, таксохинон. УФ-спектры 7αгидроксиройлеанона (горминона) и 7β-гидроксиройлеанона (таксохинона) практическиодинаковы, поэтому делается допуск содержания последнего в СО не более 5%.6. Разработка методик количественного определения горминона в постадийномконтроле получения РойлевинаМаксимум поглощения в УФ-спектрах СО горминона и спиртового экстракта корнейшалфея составляют 273 нм и 278 нм соответственно, отсюда следует, что непосредственноеизмерение оптической плотности спиртового экстракта корней некорректно.