Диссертация (Теоретические и методологические подходы к стандартизации и оценке качества лекарственного растительного сырья и масляных экстрактов на его основе), страница 10

Лучшим способомявляется одновременная модификация карбоксильной и амино- функций в АК. В таблице 20обобщены различные производные АК, которые удалось полностью разделить, или полученыдостаточно удовлетворительные результаты [317,379].Таблица 20№п/п12345678Модификация АК для определения методом ГЖХ [317,379,418]СорбентМодификация аминоМодификация карбоксильнойгруппыгруппыOV-11ТриметилсилилТриметилсилиловый эфир кислотыпроизводноеХЕ-60/QE-1/MS-200ТрифторацетилМетиловый эфир кислотыпроизводноеАпизон МБутиловый эфир кислотыПЭГ/адипат/апиезон ГептафторбутирилМетиловый эфир кислотыпроизводноеOV-1Пропиловый эфир кислотыSE-30Изоамиловый эфир кислотыКарбовакс 20-МХАцетил-производноеПропиловый эфир кислотыOV-101/OV-225ФенилтиогидантоинТриметилсилил-эфиры кислотыпроизводноеSE-30ДинитрофенилМетиловый эфир кислотыпроизводноеСиликонОксазолидинонТриметилсилил-эфиры кислотыпроизводноеOV-17Метилтиогидантоинпроизводное42Метод ГХ с масс-спектрометрическим детектированием создает идеальные возможностидля выявления пептидных структур и неизвестных АК.В последние десятилетия для анализа АК нашел широкое применение метод ВЭЖХ вразличных объектах, важными преиммущестами которого являются большая производительность и высокая точность определения [382, 387-389,396,397].Несмотря на многообразие методик определения [317,379], наиболее доступным и экспрессным в анализе АК является обращено-фазный вариант ВЭЖХ с флуориметрическим илиспектрофотометрическим детектированием.

Для оптимального разделения и идентификации,АК переводят в различные гидрофобные производные, поглощающие свет.В таблице 21 представлены обобщенные результаты анализа условий хроматографического разделения АК, приведенные в научной литературе [317,382,387-389,396,397,404,411-413,426,429].ВЭЖХ находит основное применение не только для идентификации и количественногоопределения АК, но и для разделения суммы, в том числе оптических изомеров АК в различныхобъектах анализа. Большая часть зарубежных публикаций посвящены исследованиям по выбору условий для решения данной задачи методом ВЭЖХ [317,382,387-389,396, 397,404,411413,426,429].Таблица 21Разделение АК методом ВЭЖХ [317,382,387-389,393,394,396, 397,404,407, 411-413,426,429]№Методика дериватизаХарактеристика системы для хро- Условия деОбъектып/пцииматографического разделениятектирования12345Оксипролин1Объект анализа + буShimpack CLC-C18. 150×4,6 мм.λex=470 нм,Мясоферный раствор с рН 8,0 Элюент: фосфатный буфер (0,05 Мλem=530+ NBD-Cl 5 мг/мл, прис рН 2,4) – метанол (35:65)нм60°С – 5 минОптические изомеры триптофана2Проба + боратный буSuperspher 60 PR-8e Purospher PR- λex=325 нм, Гидролифер с рН 9,5 + 1-тио-β- 18e.

125×4,0 мм. Подвижная фаза:λem=420заты белD-глюкозы тетраацетатацетонитрил и метанолков и смеи о-фталевый альдегид,си свобод6 мин – при комн. темных АКпературеАК3Проба + боратный буPhenomenex C18 250×4,6 мм.λex=470 нм, Моллюскифер с рН 8,0 + NBD-Cl, Элюент: ацетонитрил - азотная кис- λem=530 нм30 мин –при 70°С.лота (рН 3,0) Shimpack CLC-ODS150×4,6 мм.

Подвижная фаза: метанол - 0,05 М фосфатный буфер с рН2,8, с добавкой 1 мл/л триэтиламина(72:28)431456723АКПроба + боратный бу- Ultrasphere ODS 250×4,6 мм (предкофер с рН 9,5 + NBD-F, лонка 45×4,6 мм). Градиентный ре20 мин - при комн. тем- жим. Подвижная фаза А: 0,1% водпературеный раствор ТФУК. Подвижная фаза В: 0,1% раствор ТФУК в смесиацетонитрил-вода (3:1)ТауринПроба + боратный бу- Nova-Pak C 18 150×3,9 мм. Градифер с рН 9,5 + NBD-F, ентный режим. Подвижная фаза А:10 мин - при 55°Сацетонитрил-0,02 М фосфатный буфер с рН 6,5 (90:10). Подвижнаяфаза В: ТФУК и 2-пропанол (рН3,5)АКПроба + 4,7Градиентное элюирование смесями:фенантролин-5,6-дион, раствор триэтиламина - фосфатный160 мин - при 68 °Сбуфер (pH 3) - метанол. Внутреннийстандарт - хинидинАКПроба + боратный бу- Coulochem III.

Подвижная фаза: водафер с рН 8,5 + NBD-F, 3ацетонитрил-2-пропанол-ТФУКмин - при 60°С(70:30:2:0,02)45λex=470 нм,λem=530 нмПлазмакровиλex=470 нм,λem=530 нмПлазмакровиИК-, масс-, и ПрепаратыПМРАКспектры; 460нмλex=459 нм,λem=532 нмРазличныеткани иорганымлекопитающихОптические изомеры треонина8Проба + фосфатный бу- Pirkle-type chiral stationary phase/λex=470 нм, Различныефер с рН 7,5 + NBD-F, 3 Подвижная фаза: раствор лимонной λem=530 нмткани имин - при 40°Скислоты 10 ммоль/л в метанолеорганыацетонитрил (40:60)млекопитающихТФУК – трифторуксусная кислотаВ соответствии с ГОСТом [317] в кормах и комбикормах ВЭЖХ-анализ состава АК (наавто анализаторе АК) заключается в гидролизе пептидных связей белков щелочью или хлороводородной кислотой при подогревании и выборочной сорбции АК на ионообменной смоле,заполненной в жидкостную хроматографическую колонку.

При взаимодействии с нингидриномобразуется окрашенный продукт, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна содержанию в растворе АК. Метод используется для установления состава АК в отходах производства масличных и злаковых культур, а также может быть применен для анализа ЛРС.Анализаторы АК (АКА) получили широкое внедрение в практический анализ [317,379].Этот метод основывается на разделении АК на ионообменной хроматографической колонке споследующим фотоколориметрированием продуктов взаимодействия АК с нингидрином.

Приэтом, α-АК, имеющие первичную алифатическую аминогруппу, образуют с реактивом пурпурное окрашивание, интенсивность которого определяется в максимуме при 570 нм; АК, содер-44жащие вторичную аминогруппу (оксипролин и пролин) образуют с нингидрином желтое окрашивание, интенсивность которого определяют при 440 нм. Данные регистрируются в виде пиков светопоглощения элюатом из колонки АКА по завершении цветной реакции. Высота илиплощадь пика прямо пропорциональна содержанию анализируемой АК в пробе [379].Метод характеризуется высокими показателями производительности, точности определения, а также возможностью получить данные о количественном содержании, как суммыАК, так и отдельных представителей.

Основным недостатком анализа АК с применением АКАявляется высокая себестоимость одного анализа в виду дорогостоящего оборудования, что делает его малодоступным для большинства лабораторий.Несмотря на широкое внедрение методов ВЭЖХ и ГЖХ, анализ АК в с помощью ТСХнастоящее время используется посвеместно [99,105,317,379].

Для детектирования хроматограмм в большинстве случаев используют 0,2 – 2 % растворы нингидрина в спирте или ацетоне.При определении определенных АК часто применяют и более селективные реагенты. Так,предложен хроматоденситометрический метод экспресс-анализа триптофана в культуральныхжидкостях, в котором используется 0,5 % этанольный раствор 4-диметиламинобензальдегида сдобавлением 5 % концентрированной серной кислоты, избирательно взаимодействующий с индольным циклом АК [317,379].При разработке новых методик определения основной задачей становится выбор подходящих систем растворителей, обеспечивающих достаточное разделение всех анализируемыхАК. При исследовании состава АК различных объектов наиболее широко используются элюенты, представленные в таблице 22.Таблица 22Подвижные фазы, применяемые для определения АК методом ТСХ [317,379]№Компоненты подвижной фазыСоставПолярностьп/псистемы12341П-У-В(80:20:20)5,262кoнц.

аммиaк-П-2(30:70)3У-В-Б(25:25:50)5,754У-В-Б(20:20:60)5,385Б-У-В(40:10:5)4,786Б-У-В(40:10:10)5,137Б-У-В(40:10:20)5,698Б - ЭЭ - У - В(9:6:3:1)4,229Эт - концeнтрирoвaнный aммиaк(16:4,5)10П-В(70:30)5,5711Х - М - 10 % раствoр аммиака(40:40:20)12П-2 - А - 25 % раствoр аммиака - В(25:25:6:7)13П-2 - 25 % раствoр аммиака(7:3)14П - 25 % раствoр аммиака(55:45)15П-2 - Э - 25 % раствор аммиака - В(20:20:1,5:2,5)-451162М - Х - 17 % раствoр аммиака3(40:40:20)4-Э – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; М - метанол; Х – хлороформ; Б – бутанол; Эт –этанол; А – ацетон; ЭЭ - этиловый эфир; П – пропанол; П-2 – пропанол-2Анали данных таблицы 22, позволяет сделать вывод о том, что разделение зон АК нахроматограммах с наилучшим разрешением наблюдается при использовании элюентов с полярностью в диапазоне от 4,5 до 6,0.В качестве сорбентов используют стандартные материалы, такие, как оксид алюминия,силикагель, ионообменники на основе целлюлозы и ее порошок, полиамиды, а также гели наоснове декстранов и полиакриламидов [317,379].Описан способ разделения смесей АК методом двумерной ТСХ с использованием сначала системы изопропанол - ацетон - 24-25%-ный водный раствор аммиака - вода в соотношениипо объему (19,0-27,0):(20,0-26,0):(3,0-6,5):(6,0-10,0), а затем системы хлороформ - этанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении по объему (23,0-27,0):(13,5-16,0):(4,5-6,5):(1,33,5).

Для проявления используют следующие реактивы: нингидриновый, Несслера, Эрлиха и др.[317,379]. Предложена ТСХ-методика определения α-АК, осуществляемая в следующих системах: 1) н-бутанол - кислота уксусная - ацетон - вода (35:15:35:20); 2) два раза в системе изобутанол - метилэтилкетон - ацетон - 12 % раствор аммиака (10:11:10:6), а затем эта же система всоотношении 10:11:10:8; 3) первое направление в системе 1 [317].Методом двумерной ТСХ на силикагеле (Whatman, США) описан способ разделения 15из 20 основных протеиногенных АК с последовательным элюированием в двух подвижных фазах: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5) и фенол - вода (15:1). Этот вариант разделенияАК, по сравнению с другими известными аналогами, наиболее эффективен, но занимает >7 ч наодин анализ.В [317] описан еще один способ разделения АК на двух пластинках одновременно, помещенных в две разные камеры.

В камере для АК с коэффициентами подвижности < 0,3, разделение проводят в элюенте, состоящем из пропанол: 24 – 42,5% водный раствор аммиака:вода(3,3 - 4,1):(0,9 -1,5):(7,5 - 9,0), а в другой - для АК с коэффициентом подвижности 0,3-1,0, разделение осуществляют в системе растворителей хлороформ:этанол:уксусная кислота:вода (52,554,0):(26,0 - 27,5):(8,9 - 9,6):(3,5 - 4,2) по объему.Разработана методика разделения и определения количественного содержания 14 свободных АК в условиях восходящего двумерного хроматографирования на пластинках типа«Армсорб» (таблица 23). При использовании в первом направлении подвижной фазы: гептан дихлорэтан - уксусная кислота (20:30:30); а во втором направлении - бутанол - уксусная кислота- вода (80:20:20) наблюдается наилучшее разделение смеси АК [317].46Таблица 23Величины Rf АК, полученные на пластинках «Армсорб» методом двумерной ТСХ [317]АКRf±0,02АКRf±0,02Аргинин0,12Изолейцин0,55Аланин0,30Лейцин0,63Аспарагин0,22Метионин0,14Валин0,48Орнитин0,71Глутамин0,33Таурин0,28Глицин0,37Триптофан0,50Гистидин0,18Глутамин0,17Описан способ разделения АК, модифицированных путем ацилирования остатками жирных кислот, основанный на двукратном элюированием сначала в системе гексан-диэтиловыйэфир ((1,5-2):1), а далее в системе гексан-диэтиловый эфир-ацетон (1:1:0,6).

Детектирование зоносуществляется в УФ-свете [317].ТСХ является достаточно высокоточным методом определения, не требует примененияоборудования с высокой стоимостью. Однако практическое использование данного методаограничено такими недостатками, как длительность процедуры анализа (до нескольких суток),нестабильность во времени окраски продукта реакции нингидрина с АК. Поэтому временнойфактор следует учитывать при определении количества АК методом ТСХ, основанном на измерении оптической плотности продукта цветной реакции. Метод ТСХ сегодня используют дляпредварительного исследования, более полные данные о качественнм составе АК в исследуемых образцах получают при использовании КЭ, АКА, ГЖХ и ВЭЖХ.Бумажная хроматография (БХ) является одним из самых доступных методов исследования качественного и количественного состава АК в различных объектах.