Диссертация (Разработка инъекционных лекарственных форм цифетрилина), страница 10

A.,Италия);Моечно-дезинфекционная машина Lancer 1400 UP DIN (Lancer, Франция);Стерилизатор сухожаровой Binder ED (Binder, Германия);Полуавтомат ПЗР-34-ВИПС-МЕД для укупорки флаконов колпачками К-220 и К-3-34 (ООО «Фирма «ВИПС-МЕД», Россия);Система получения воды для инъекций УВОИ-М-Ф/1812 (МедианаФильтр,Россия).2.3. Методы исследований2.3.1. Получение липосомА.

Получение липосом с цифетрилиномНавески цифетрилина и ингредиентов липосомального бислоя –ЯФХ, холестерин и ПЭГ-ДГФА растворяли в хлороформе. Полученныйраствор фильтровали через нейлоновый мембранный фильтр «Pall» сразмером пор 0,22 мкм, переносили в круглодонную колбу и упаривали нароторном испарителе при температуре водяной бани 37 ± 1 ºС в условияхнизкого давления до образования полупрозрачной липидной пленки.

Дляудаления остаточного растворителя пленку досушивали под вакуумом(120–150 мбар) до постоянной массы и гидратировали с получениемдисперсии МСЛ цифетрилина, которую фильтровали под давлением черезфильтры с диаметром пор 1,2 и 0,45 мкм. Для получения ОСЛпрофильтрованную дисперсию экструдировали, многократно пропускаячерез мембранные фильтры с диаметром пор 0,2–0,22 мкм (нейлоновые,поликарбонатныеифильтрыизсложныхэфировцеллюлозы),гомогенизировали на микрофлюидайзере или обрабатывали в УЗ-ванне.56Б. Получение «пустых» липосом«Пустые»липосомыполучалианалогичнолипосомамсцифетрилином, но без добавления в хлороформный раствор ЛВ.2.3.2. Стерилизация липосомальной дисперсии цифетрилинаТак как ЛЛФ цифетрилина предназначена для инъекции, к нейпредъявляется требование стерильности.

Для стерилизации липосомальнойдисперсии цифетрилина применяли метод фильтрации под давлением сиспользованием стерилизующих мембранных фильтров с диаметром пор0,45 и 0,22 мкм (пред- и стерилизующая фильтрация).2.3.3. Получение лиофилизированных липосом ЦифетрилинаДля повышения стабильности и увеличения срока хранения ЛЛФцифетрилина предложен метод сублимационной сушки.Основной задачей этапа лиофилизации ЛЛФ цифетрилина являлисьвыбор режима лиофилизации и криопротектора, которые бы обеспечивалиполучение лиофилизата надлежащего качества, стабильного в течениедлительного срока хранения.

Криопротектор вводили в липосомальнуюдисперсию цифетрилина в этапе гидратации пленки.Дляопределенияэвтектическойтемпературыцифетрилинаиспользовали термический способ, в основе которого лежит фиксированиетемпературы образца, замороженного ниже эвтектической точки, впроцессе медленного оттаивания.Выбороптимальногорежимасублимационнойсушкилипосомального цифетрилина проводили на основании сравнительногоанализа двух способов лиофилизации – с «медленным» (1) и «быстрым»замораживаем (2) [3, 13].Прикомнатнойтемпературе(+20~+25ºС)липосомальнуюдисперсию цифетрилина дозировали в стерильные флаконы по 6,0 мл ипомещали в камеру сублимационной сушки.571–Режимлиофилизациис«медленным»замораживаем.Напервоначальном этапе охлаждали полки до –15~–17 °С. После достижениязаданной температуры препаратом выдерживали его при таких условиях втечение 50 мин.

Весь этап длится 2,5~3 ч. Второй этап состоял вдоведении значений температуры полок и препарата до –25~–27 °С итакже выдерживанием на протяжении 50 мин. Этап длился 1,5~1,8 ч.Третий этап состоял из понижения температуры полок и препарата до –35~–37 °С и такую температуру поддерживали 40 минут. Общее времяэтапа составило 1,3~1,6 ч. На четвёртом этапе температуру полокдоводилидо–45~–47уравновешивания°С.Послеминимальнойдостижениятемпературы(1,3~1,6продуктач)ифлаконыспрепаратом выдерживали в течение 3 ч, далее начинали откачку воздуха изкамеры сублимационной установки.

После включения вакуумного насоса ивыравнивания вакуума осуществляли: нагрев полок до температуры –20 °Ссо скоростью +5 °С/ч; выдерживание полок на температуре –20 °С втечение 2 ч; нагрев полок до температуры –10 °С со скоростью +3 °С/ч;нагрев полок до комнатной температуры +20~+22 °С со скоростью +5 °С/ч.Далее препарат досушивали для удаления остаточной влаги около 3 ч покритерию неизменности остаточного давления паров в сублимационнойкамереприперекрываниивакуумноймагистрали.Общеевремялиофилизации препарата составило приблизительно 32 ч.2–Режимлиофилизациис«быстрым»замораживанием.Напервоначальном этапе охлаждали полки и препарат сублимационнойсушки до −45 °C в течение 2 ч.

После достижения заданной температурына препарате выдерживали в течение 3 ч (стадия замораживания). Затемвключали вакуум в камере. После выравнивания температуры и вакуума(около 3 ч) начинали сублимационную сушку, поднимали температуру от−45 до +20 °C со скоростью 5 °C/ч (сублимационная сушка). После58достижения на препарате температуры +20 °C выдерживали при этойтемпературе в течение 3 ч (досушивание). Общее время сублимационнойсушки составило 24 ч.2.3.4. Методы анализа ЛЛФ и ЛЛФ-лио цифетрилина− Количественное определение цифетрилина в липосомах до ипосле лиофилизацииСодержаниецифетрилинавлипосомахопределялиметодомспектрофотометрии в УФ- и видимой областях с применением рабочегостандартного образца (СО) цифетрилина при длине волны (282 ± 2) нм.При разработке методики количественного спектрофотометрическогоанализаЛФцифетрилинаруководствовалисьОФС.1.2.1.1.0003.15«Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях» [2].

Методикаколичественного анализа липосомального цифетрилина представлена вразделе собственных исследований 4.2.3.− Методика определения «количества включенного препарата»(КВП)Цифетрилин – гидрофобное вещество, поэтому количество препаратаопределялипосредствомфильтрованиястерильнойлипосомальнойдисперсии через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм. КВПрассчитывали,какотношениеконцентрациицифетрилинавлипосомальной дисперсии после фильтрации (Сф) к его содержанию вдисперсии,полученнойпослегидратациилипиднойплёнки(С п).Показатель выражался в процентах:КВП = Сф / Сп × 100 %− Качественный анализ ЛЛФ-лио цифетрилинаИдентификациюкомпонентовЛЛФ-лиопроводилисиспользованием метода тонкослойной хроматографии.

При разработкеметодикихроматографическогоанализа59ЛФцифетрилинаруководствовались ОФС.1.2.1.2.0003.15 «Тонкослойная хроматография» иГОСТ28366-89Методика«Реактивы.качественногоМетодтонкослойнойхроматографическогохроматографии».анализаЛЛФ-лиоцифетрилина представлена в разделе собственных исследований 4.2.1.− Определение размера липосом цифетрилинаАвтоматической пипеткой отмеривали 100 мкл исследуемогообразца свежеприготовленных липосом или ЛЛФ-лио цифетрилина послерегидратации (спустя 10 мин после регидратации), помещали в мернуюколбу вместимостью 100 мл и доводили водой до метки. Разведенныйобразец переносили в стеклянную кювету, которую помещали в ячейкуанализатора и проводили измерение.− Определение формы липосом с использованием электронноймикроскопииОбразец наносили на коллодиево-угольную плёнку-подложку, затемконтрастировали 1 % с помощью раствора уранил ацетата и далеепросматривали на электронном микроскопе марки с разрешением во времясканирования 1200 dpi, увеличивая в 20000 раз.

Для точного подсчетаувеличения использовали фото частиц латекса, имеющих средний диаметр109 ± 3 нм.− ОпределениезначениярНлипосомальнойдисперсиицифетрилина до и после лиофилизацииЗначение рН в липосомальной дисперсии измеряли, не разбавляя. Сцелью определения рН лиофилизата к нему добавляли 10 мл воды ипроводили измерение, предварительно измерив значение рН воды.

Всеизмерения осуществлялись в интервале температур от 20 до 25 °С.− Определения концентрации малонового диальдегида по реакциис тиобарбитуровой кислотойОпределяли концетрации малонового диальдегида (МДА,конечногопродукта перекисного окисления ФЛ) по реакции с 2-тиобарбитуровой60кислотой (ТБК). С целью анализа применяли деионизированную водуввиду того, что данный метод весьма чувствителен к наличию в образцеионовдвухвалентныхметаллов.Анализпроводилипометодике,представленный в разделе 3.1.2.Приготовление реагентаОтмерили 0,67 г ТБК и 15,00 г трихлоруксусной кислоты (ТХУК),затем растворяли в 100 мл деионизированной воды, затем раствор,который получали, нагревали на водяной бане с целью растворениятвердых веществ.Проведение анализа0,5 мл образца, подвергшийся анализу, помещали в чистую пробирку(аименно,лиофилизатилилипосомальнуюдисперсию,которыйрастворяли в 5,3 мл воды) и 3,0 мл смеси ТБК и ТХУК, перемешивали и вдальнейшем нагревали на водяной бане на протяжении 30 мин.Оптическуюплотностьраствора,которыйполучали,измерялиотносительно смеси ТБК и ТХУК при 532 и 580 нм и далее производилирасчёт содержания в пробе МДА (нмоль/мл) согласно формуле:С= (А532 – А580) × 6 ×1000 / 155,здесь А532 – оптическая плотность образца при длине волны 532 нм; А580 –оптическая плотность образца при длине волны 580 нм; 6 – коэффициентразведения образца; 155 – коэффициент молярной экстинкции МДА-ТБК2,мл/(мкмоль·см).− Определение потери в массе при высушиванииПотерю в массе при высушивании (влажность) определяли,руководствуюсь ОФС.1.2.1.0010.15 «Потеря в массе при высушивании» [2].Результат выражали в виде массовой доли в процентах.Для анализа точную навеску препарата (0,5 г) помещали впредварительно высушенный и взвешенный бюкс и сушили до постоянноймассы в вакуумном сушильном шкафу над пятиокисью фосфора прикомнатной температуре и остаточном давлении 5 мм рт.ст.612.3.5.

Статистическая обработка результатовСтатистическую обработку полученных в ходе эксперимента данныхпроводиливпрограммахExcel,Origin6.1,руководствуясьОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химическогоэксперимента» [2].62РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙГлава 3. Разработка состава и технологии получения ЛЛФ-лиоцифетрилина3.1. Разработка состава ЛЛФ цифетрилина3.1.1. Выбор оптимального состава ЛЛФ цифетрилинаВыбор компонентов для создания ЛЛФ цифетрилина основывался наих функциональном назначении.