Диссертация (Состояние микробиоценоза толстого кишечника, липидного состава клеточных мембран и антиоксидантного статуса животных при экспериментальном дисбиозе), страница 9

Далее, пластины высушивали в вытяжной камерев течение 10 минут. Фракции выявляли путем опрыскивания пластин 5%раствором фосфорно-молибденовой кислоты в 96% растворе этанола, с45последующим нагреванием пластин в сухожаровом шкафу при температуре 150°Св течение 7 минут [66, 76, 78, 123].Идентификация липидных фракцийДля идентификации применяли стандартные образцы нейтральных липидови фосфолипидов производства фирмы «Sigma» (USA), путем определенияотносительной подвижности фракций.Количественное определение липидов мембран эритроцитовУровень содержания липидов определяли денситометрическим методом наПВМ IBM PA/AT с использованием программы «OneDscan» в отраженном свете.Распределение липидного материала в пятне практически соответствовалогауссовской кривой и обеспечивало пропорциональность между количествомлипидов и площадью их пиков.

При анализе определяли относительнуюоптическуюплотностьвыражения(взависимостьмг/дл),данногостроилиотносительнойвещества.Дляточногоколлибровочныеоптическойплотностиколичественногографики,ототражающиеколичественногосодержания вещества [2, 66, 76, 78].2.5 Изучение эффективности профилактического и лечебного использованияантиоксиданта и пробиотиков при экспериментальном дисбиозеЭксперимент проводили на 400 мышах линии BALB/c массой тела 18-20граммов. Содержание, питание, уход за животными и выведение их изэксперимента проводили с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции позащите прав позвоночных животных, используемых для экспериментальных идругих целей (Страсбург, Франция, 1986), правил лабораторной практики РФ(приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003).Выбор экспериментальных животных,протоколы проведения экспериментальных исследований, вывод животных изэксперимента утвержденны на проблемной комиссии и региональным этическимкомитетом (протокол № 2 от 16.06.2014 г.).Для решения поставленных задач животные были разделены на 8 групп (по50 мышей в каждой).

Первая группа – контрольная (интактные мыши). Вторую46группу составили животные, у которых моделировали лекарственный дисбиозпутём однократного ежедневного (в течение 5 дней) внутрибрюшинного введенияраствора гентамицина. Концентрация вводимого антибиотика составляла 80мкг/мл в пересчёте на массу животного. В третью группу входили мыши,которым с профилактической целью внутримышечно вводили антиоксидантэмоксипин в рекомендуемой дозе 167,18 мг/кг в пересчёте на массу животного втечение 10 суток до начала моделирования дисбиоза. Четвертой группеживотных с целью коррекции внутримышечно вводили антиоксидант эмоксипинв дозе 167,18 мг/кг в пересчёте на массу животного в течение 10 суток послеформирования дисбиоза.

Мышам пятой группы по окончанию введенияантибиотика интрагастрально вводили пробиотик «РиоФлора Иммуно Нео» втечение трех недель. Шестую группу составили животные, которым послеформирования лекарственного дисбактериоза вводили антиоксидант эмоксипин(внутримышечно в течение 10 суток) и пробиотик «РиоФлора Иммуно Нео»(интрагастрально в течение 21 дня).

Мыши седьмой группы после формированиядисбиоза интрагастрально получали пробиотик «Бифиформ» в терапевтическойдозе в течение 21 дня. Восьмую группу составили животные, которым послеформирования лекарственного дисбактериоза вводили антиоксидант эмоксипин(внутримышечно в течение 10 суток) и пробиотик «Бифиформ» (интрагастральнов течение 21 дня).Поокончаниисроковэкспериментаизучаликоличественныйикачественный состав микробиоценоза муцинового слоя толстого кишечника,состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса в плазме крови и тканитолстого кишечника, состояние липидного состава мембран эритроцитов кровимышей.2.6 Статистическая обработка полученных данныхОбработкаданныхосуществляласьпостандартнымметодикамвариационной статистики.

Проводилась проверка всех данных на нормальностьраспределения признака. Для этого использовали критерий Колмагорова-47Смирнова. Если полученные p для данного статистического теста были вышекритического (p=0,05), то распределение считали, подчиняющемся законунормального распределения. Из этого следовало, что для дальнейшегостатистического анализа использовались параметрические методы обсчетаданных.

При описании количественных признаков использовались параметрынормального распределения: среднее значение (M), стандартная ошибка среднегозначения (±m), стандартное отклонение (σ), дисперсия (σ²). Для проверкистатистических гипотез использовали критерий Стьюдента (t). Пороговыйуровень статистической значимости принимали равный 0,05 [117].Всевычислениявыполнялисьспомощьюаналитическогопакетаприложения Excel Office 2010, лицензией на право использования которойобладает ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава РФ.48РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙГЛАВА 3СОСТОЯНИЕ ПРИСТЕНОЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ ТОЛСТОГОКИШЕЧНИКА И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙКРОВИ И КОЛОНОЦИТОВ МЫШЕЙ В УСЛОВИЯХЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИСБИОЗА3.1 Состояние пристеночной микрофлоры толстого кишечника мышей вусловиях экспериментального дисбиозаМикроэкологическая система организма – это сложный филогенетическисложившийся динамичный комплекс, включающий в себя разнообразные поколичественному и качественному составу ассоциации микроорганизмов ипродукты их биохимической активности в определённых условиях средыобитания[49, 51].Составмикрофлорыкаждогобиотопапищеварительноготрактаразличается, но остаётся постоянным, что связано со способностью бактерийфиксироваться к строго определённым рецепторам эпителиальных клетокслизистой оболочки, локализованным в толще гликокаликса, покрывающегоапикальную плазмолемму эпителиоцитов [154].Первым этапом нашего исследования явилось изучение состава кишечноймикрофлоры интактных мышей, составляющих контрольную группу.При исследовании количественного и качественного состава мукознойнормофлоры толстого кишечника интактных животных было установлено, что всоставе микрофлоры преобладали облигатные представители микробиоценоза –бифидобактерии, lgКОЕ которых составил 7,93±0,93(таблица 3).49Таблица 3 – Количественный состав мукозной микрофлоры кишечника мышей вусловиях экспериментального дисбиозаВыделенные микроорганизмыКоличество микроорганизмов, lgKOE/г (M±m)Группы животныхКонтрольДисбиоз(интактные мыши)E.

colic нормальной ферментативной6,77±0,783,95±0,53**активностьюE. colicо сниженной ферментативной4,37±0,767,03±0,95*активностьюEnterobacter spp.4,47±0,792,37±0,56*Salmonella spp.5,65±0,666,44±0,86Citrobacter spp.4,37±0,920±0***Enterococcus spp.3,42±0,900±0***Streptococcus spp.2,93±0,606,17±1,09*Staphylococcus2,74±0,604,10±0,75(коагулазоотрицательные)Staphylococcus aureus03,40±0,62***Proteus spp.04,01±0,66***Candida spp.1,26±0,324,94±0,74***Lactobacillus spp.6,15±0,703,73±0,77*Bifidobacterium spp.7,93±0,934,24±0,72**Примечание: * - р≤0,05 по сравнению с контрольной группой, ** - р≤0,01 по сравнению сконтрольной группой, *** - р≤0,001 по сравнению с контрольной группой.В несколько меньшем количестве обнаруживались E. colic нормальнойферментативной активностью (lg 6,77±0,78) и лактобактерии, численностькоторых составила lg 6,15±0,70.Кроме того, в составе микрофлоры животных контрольной группыобнаруживались представители рода Salmonella (lg 5,65±0,66), а содержаниекишечных палочек со сниженной ферментативной активностью составило lg2,74±0,60.Количествопредставителейусловно-патогенныхэнтеробактерий–микроорганизмов родаEnterobacter было lg 4,47±0,79.

Citrobacter иEnterococcusбыли обнаружены в составе мукозной микрофлоры экспериментальных животныхв количествеlg 4,37±0,92 и lg 3,42±0,90 соответственно.Несколько ниже было число представителей факультативной флоры–коагулазоотрицательных стафилококков, lg КОЕ которых составил 2,74±0,60ибактерий рода Streptococcus (lg 2,93±0,60).50Грибы рода Candida присутствовали в незначительном количестве (lg1,26±0,32). При этом в составе мукозной микрофлоры интактных мышей неопределялись золотистые стафилококки и микроорганизмы рода Proteus.Экспериментальныйвведениемгентамицина,дисбиозтолстогохарактеризовалсякишечника,уменьшениемобусловленныйчисленностидоминантных представителей микрофлоры интактных животных (таблица 3).Содержание бифидобактерий снизилось в 1,9 раза и составило lg 4,24±0,72против lg 7,93±0,93 в контроле.Количество кишечных палочек с нормальной ферментативной активностьюи лактобактерий уменьшилось в 1,7 раза и составило lg 3,95±0,53 и lg 3,73±0,77соответственно.

При этом число эшерихий со сниженной ферментативнойактивностью увеличилось в 1,6 раза, lg КОЕ которых составил 7,03±0,95 против4,37±0,76 в группе интактных животных.Численность факультативных микроорганизмов – стрептококков возросла в2,1 раза по отношению к контролю и составила lg 6,17±1,09.Содержание условно-патогенных бактерий рода Enterobacter в контролесоставляло lg 4,47±0,79, а после воздействия антибиотика широкого спектрадействия гентамицина их количество уменьшилось в 1,9 раза и составило lg2,37±0,56.В составе микробиоценоза данной экспериментальной группы не выявленобактерий рода Citrobacter и Enterococcus, тогда как отмечалось появлениеотсутствующих в контроле золотистых стафилококков и бактерий рода Proteus,lgКОЕ которых составил 3,40±0,62 и 4,01±0,66 соответственно.На фоне применения гентамицина в составе микробиоценоза толстогокишечника мышей количество грибов рода Candida увеличилось в 3,9 раза исоставило lg 4,94±0,74 против lg 1,26±0,32 в контрольной группе интактныхживотных.Что касается коагулазотрицательных стафилококков и сальмонелл, тоизменения их численности были недостоверны по отношению к контролю.513.2 Изменение молекулярно-биохимических показателей крови иколоноцитов мышей в условиях экспериментального дисбиозаВ настоящее время в генезе многих заболеваний важное значение придаетсямембрано-патологическим процессам.