Диссертация (Создание липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора на основе борированного хлорина E6), страница 12

Важным вопросом является разработка методаопределения количества включенного в липосомы ЛВ, причем такиеопределения должны проводиться как в процессе изготовления липосом и ихлиофилизации, так и при хранении препарата в течение срока его годности.Этот вопрос должен решаться для каждого вида липосом непосредственноразработчиком препарата, при этом валидация аналитических методовявляется обязательным условием его использования.К одному из проблемных вопросов можно отнести испытание намеханические включения (посторонние частицы).

Их определение само посебе сложно, во-первых, так как препарат представляет собой окрашеннуюэмульсионную жидкость, а во-вторых, препарат лиофилизирован, что требуетвысокого качества стекла и укупорочных материалов, класса чистоты приизготовлении и розливе препарата (класс А) [51].Одним из основных требований к препаратам парентеральноговведения является отсутствие пирогенности. Учитывая, что пирогенныевещества,вбольшинствеслучаев,являютсябактериальнымилипополисахаридами и обладают большой устойчивостью к нагреванию(разрушаются только при длительной обработке при температуре выше200°С), получение липосомальных препаратов, начиная от липиднойсубстанции до готового препарата, необходимо осуществлять в условияхасептики, предотвращая загрязнение материалов как микроорганизмами, таки продуктами их жизнедеятельности.

С учетом этих факторов, ввидуневозможностикомпонентовиспользованияформируемыхтермическойлипосом,приобработкиизготовленииотдельныхлипосомныхпрепаратов следует применять стерильные и апирогенные составляющие:липидные субстанции, воду для инъекций, стабилизаторы [49].69ЗАКЛЮЧЕНИЕФДТ представляет перспективный метод лечения злокачественныхновообразований и ряда неопухолевых заболеваний, который яляетсярезультатом комбинированного действия двух компонентов – ФС и света.Одним из ведущих направлений развития и совершенствования ФДТзлокачественных новообразований является создание ФС, обладающихвысокой фототоксичностью активностью. В течение двух последнихдесятилетий большой интерес в качестве ФС вызывают производныехлорофилла, в частности хлорины. ФС хлоринового ряда обладаютинтенсивной полосой поглощения в длинноволновой красной областиспектра, оптимальной туморотропностью и высокой фототоксичностью приотсутствии «темновой» токсичности, что обусловлено быстрым выведениемпрепарата из организма.Борхлоринпредставляетсобойоригинальныйотечественныйфотосенсибилизатор, борированное производное хлорина е6, с максимумомпоглощения около 662 нм, который благодаря своим свойствам являетсявесьмаперспективнымпрепаратомдляФДТзлокачественныхновообразований.

Результаты доклинических исследований показали, чтоборхлорин обладает достаточно высокой фотодинамической активностьюпри лечении меланомы В-16, саркомы М-1, карциномы Эрлиха икарциономы Льюиса.Однако борхлорин имеет существенный недостаток – низкуюрастворимость в воде, что обуславливает сложность его внутривенноговведения при проведении ФДТ.Одним из возможных способов солюбилизации гидрофобных ФСявляется их включение в биосовместимые фосфолипидные везикулы –липосомы. Использование липосом позволяет повысить накопление ФС вопухоли посредством пассивного нацеливания и снизить его накопление в70здоровых тканях, защитить ФС от деградации и преждевременного клиренса,а также обеспечивает проникновение ФС в опухолевую клетку.Создание ЛЛФ – многофакторная задача, решение которой требуетучета всех ее многочисленных составляющих – от выбора исходныхкомпонентов до контроля качества конечного продукта.

А свойстваконечного продукта, главным образом, зависят от поставленной цели итехнологических возможностей разработчика. Существенным образом насвойствалипосомвлияютметодыихполучения.Оттехнологииприготовления зависит размер везикул, степень окисления липидов,входящих в состав оболочки, ЭВ инкапсулируемого вещества, стабильностьпри хранении и другие показатели.71ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬГлава 2. Материалы и методы исследования2.1.

Материалы и реактивыПрипроведениитехнологическихихимико-фармацевтическихисследований ЛЛФ-лио борхлорина использовали химические субстанции иреактивы, которые соответствовали требованиям нормативной документации(ГОСТов, ТУ, фармакопейных статей ГФ XIII, Ph Eur 7.0, USP30-NF25).Действующее вещество:Борхлорин – мелкокристаллический порошок зеленого цвета с Тпл. выше200°С; практически не растворим в воде; хорошо растворим в хлороформе,тетрагидрофуране, хлористом метилене, этилацетате; растворим в этаноле; нерастворим в толуоле, метаноле, гексане, гептане.

Молекулярная масса(М)=844,84 г/моль.Компоненты липосомальной мембраны:Яичный фосфатидилхолин Е РС S (ФХ) (Lipoid, Германия) – порошок белогоцвета с желтоватым оттенком; растворим в хлороформе, метаноле, этаноле,толуоле, эфире; не растворим в воде и ацетоне. М=751 г/моль.Холестерин (Avanti Polar Lipids, Inc., США) – кристаллический порошок отбелого до бледно-желтого цвета без запаха или со слабым запахом,чувствителен к действию света.

Легко растворим в хлороформе и диэтиловомэфире, растворим в 1,4-диоксане, умеренно растворим в ацетоне и этаноле,практически не растворим в воде и метаноле. М=386,7 г/моль.PEG-2000-DSPE18:0(1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси (полиэтиленгликоль)-2000] аммониевая соль) (ПЭГ-ДГФА) (Lipoid,Германия) – порошок белого цвета, растворим в хлороформе, толуоле,метаноле и этаноле, не растворим в воде и ацетоне. М=2787,49 г/моль.Криопротекторы:Сахароза, ГОСТ 5833-75 (Химмед, Россия);Трегалоза-D дигидрат «ОСЧ» (Химмед, Россия);72Лактоза безводная Ph Eur (Sigma-Aldrich GmbH, Германия);Глюкоза моногидрат, ГОСТ 975-88 (Химмед, Россия);Маннит имп.

(ООО «Реахимкомплект», Россия).Растворители:Аммиак водный 25% ОСЧ (ГОСТ 24147-80) (Химмед, Россия);Ацетон ЧДА (ГОСТ 2603-79 изм. 1, 2) (Химмед, Россия);Вода очищенная, ФС.2.2.0019.15;Вода для инъекций, ФС.2.2.0020.15;н-Бутанол ЧДА (ГОСТ 6006-78) (ЗАО Экос-1, Россия);Ледяная уксусная кислота ХЧ (ГОСТ 61-75, изм. 1-3) (ЗАО «Мосреактив»,Россия);Метанол ХЧ (Химмед, Россия);Пропанол-2 (изопропиловый спирт) ОСЧ (ТУ-6-09-07-1718-91) (Химмед,Россия);Спирт этиловый 95%, ФС.2.1.0036.15 (ЗАО «Брынцалов-А» Ферейн, Россия);Хлороформ (трихлорметан) стабилизированный ХЧ (Химмед, Россия);Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты) ХЧ, (Химмед, Россия).Иные реактивы:Натрия хлорид ХЧ, ГОСТ 4233-77, (Химмед, Россия);α-Токоферола ацетат, раствор масляный 30% (Марбиофарм, Россия);Йод кристаллический Ч, ГОСТ 4159-79 (Химмед, Россия).Вспомогательные материалы для фильтрации и экструзии:Поликарбонатные мембранные фильтры «Nuclepore» диаметром 25 мм, сразмером пор 0,2 мкм (Whatman, Великобритания);Нейлоновые мембранные фильтры «Pall» N66 диаметром 25, 47 и 90 мм и сразмером пор 1,2; 0,45 и 0,22 мкм (Pall Corporation, США; ООО ПаллЕвразия, Россия);Поливинилиденфторидовые мембранные фильтры «Durapore» диаметром 90мм и с размером пор 0,1 мкм (Millipore, Ирландия).73Вспомогательные материалы для проведения ТСХ:Пластинки «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А.

Тип сорбента – силикагель СТХ-1ВЭ.Зернение – 8-12 мкм. Толщина слоя – 100 мкм. Связующее вещество –силиказоль. Тип подложки – алюминий. Размер пластин – 10×15 см.Стеклянная камера с крышкой для ТСХ-анализа.Вспомогательные материалы для спектрофотометрии:Кюветы с крышкой для спектрофотометрии (Россия).2.2. ОборудованиеВесы аналитические Sartorius 2405 (Sartorius AG, Германия);Весы лабораторные Sartorius LA1200S (Sartorius AG, Германия);Испаритель роторный Rotavapor R-200 (Büchi Labortechnik AG Швейцария);Водяная баня Büchi Heating Bath B-490 (Büchi Labortechnik AG Швейцария);Ультразвуковая ванна Transsonic T310 (Elma, Германия);Экструдеры LipexTM Thermobarrel Extruder 10, 100 и 800 мл (Northern LipidsInc., Lipex Biomembranes, Inc., Канада);Гомогенизатор Microfluidizer M-110S (Microfluidics, США);pH-метр HANNA рН 211 (Hanna Instruments, Германия);Наносайзер Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems,США);Спектрофотометр Cary 100 (Varian, Inс., Австралия);Сублимационная сушка «Edwards Minifast DO.2» (Ero Electronic S.p.

A.,Италия);Моечно-дезинфекционная машина Lancer 1400 UP DIN (Lancer, Франция);Стерилизатор сухожаровой Binder ED (Binder, Германия);Полуавтомат ПЗР-34-ВИПС-МЕД для укупорки флаконов колпачками К-2-20и К-3-34 (ООО «Фирма «ВИПС-МЕД», Россия);Система получения воды для инъекций УВОИ-М-Ф/1812 (МедианаФильтр,Россия).742.3. Методы исследований2.3.1.

Методы получения липосомА. Метод получения многослойных липосом (МСЛ) борхлоринаЛипосомы борхлорина получали методом гидратации липидной пленкив модификации для гидрофобных субстанций. Точные навески борхлорина,ФХ, холестерина и ПЭГ-ДГФА растворяли в хлороформе, полученныерастворысмешивалиорганическийипереносилирастворительотгоняливкруглодоннуюнароторномколбу.Далееиспарителепритемпературе водяной бани 37±1 ºС под вакуумом (-0,8 бар) до полученияоднородной полупрозрачной липидной пленки, которую досушивали подвакуумом (-0,9 бар) в течение 50 мин. Липидную пленку гидратировали собразованием дисперсии многослойных липосом борхлорина.

Подробнометод изложен в разделе 3.2.1.Б. Методы получения однослойных липосом (ОСЛ) борхлоринаДля получения однослойных и однородных по размеру везикулиспользовалиследующиеметоды:экструзия,УЗ-обработкаигомогенизация/микрофлюидизация. Предварительно полученную дисперсиюМСЛ фильтровали через нейлоновые мембранные фильтры «Pall» сдиаметром пор 1,2 и 0,45 мкм.1) Экструзия.

Профильтрованную дисперсию МСЛ пропускали черезполикарбонатные мембранные фильтры «Nuclepore» с размером пор 0,2 мкм,нейлоновые мембранные фильтры «Pall» с размером пор 0,22 мкм иполивинилиденфторидовые мембранные фильтры «Durapore» с размеромпор 0,1 мкм с использованием экструдера под давлением 0,9-1,0 МПа.2) УЗ-обработка. Профильтрованную дисперсию МСЛ в объеме 30 млизмельчали на УЗ-диспергаторе Transsonic 310 с частотой 20 кГц в течение15-60 мин.753) Гомогенизация. Профильтрованную дисперсию МСЛ в объеме 60 млизмельчали на гомогенизаторе Microfluidizer под давлением 40 psig (280 кПа)в течение 1-5 мин.В. Метод получения «пустых» липосом.«Пустые» липосомы получали, как и липосомы с действующимвеществом,нобездобавлениясубстанцииборхлоринавсоставхлороформного раствора вспомогательных компонентов.2.3.2.