Диссертация (Создание липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора на основе борированного хлорина E6), страница 11

Повышение температуры можетпривеститакжекинактивациивключаемыхвлипосомытермочувствительных веществ, например белков, ДНК и др.Экструзия с использованием фильтрующих мембран. Согласно методу,дисперсии МЛВ пропускают через мембранные фильтры под высокимдавлением с помощью специального оборудования – экструдеров. Подбираяфильтры с подходящим размером пор, можно получить липосомы желаемогодиаметра. При продавливании МЛВ сквозь малые поры снимаютсяпоследовательные слои мембран, и остается только один слой. Кромеуменьшения размера липосом, метод позволяет получить липосомы сгомогенным распределением по размеру.

С применением этого метода могутиспользоваться различные липиды для получения стабильных липосом [110].Гомогенизация/микрофлюидизация. Для крупномасштабного производствалипосомпредложенатехникагомогенизации(микроэмульгирования).Преимуществами этого метода является высокая производительность метода(до 150 л препарата в сутки), стандартность и реальная возможностьпостоянного контроля температуры и давления. Процесс проводят вгомогенизаторе высокого давления, в результате происходит разрушениекрупных везикул при пропускании дисперсии МЛВ под высоким давлениемчерез специальный клапан. В ходе процесса дисперсия подвергаетсянеоднократной циркуляции через гомогенизатор, при этом дисперсиюнеобходимо непрерывно охлаждать для отвода тепла, выделяемого насосомпри сжатии [50].Условия гомогенизации необходимо подбирать для каждого видалипосом, причем определяющими являются величина липосом и степеньвключения субстанции.

На стабильность липосом и включение вещества в ихсостав оказывает влияние ионная сила, величина рН, температура проведения63процесса. Кроме того, самостоятельное значение имеет стабильность самогоЛВ (субстанции), включаемого в липосомы [51].Большое влияние на размер везикул, полученных в результатегомогенизации, оказывают давление гомогенизации и число циклов. Размерлипосом непрерывно уменьшается при постоянной рециркуляции и, вконечном счете, приближается к постоянной величине. Однако в некоторыхслучаяхпоследостиженияминимальногоразмерапридальнейшемизмельчении липосомы могут укрупняться [90].1.2.6. Стерилизация липосомТехнология получения ЛЛФ ряда препаратов в настоящее времядостаточно хорошо разработана, но во всей цепи технологических процессовесть по крайней мере один этап, еще не нашедший удовлетворительноготехнического решения, – этап стерилизации, необходимый потому, чтолипиды являются хорошей питательной средой для развития многих видовмикроорганизмов [15].Наиболеефильтрация.часто применяемыйСтерилизующаяпредставляющийсобойметодфильтрацияфильтрациюстерилизации липосом–методпрепаратов–стерилизации,черезстерильныйфильтрующий материал под давлением.

С целью подбора оптимальногофильтра должны производиться исследования, приводящие к минимальнойсорбцииактивнойсубстанцииикомпонентовлипосом[51].Длястерилизации могут быть использованы мембранные и глубинные фильтрыкоторые задерживают частицы диаметром более 200 нм. Этот способстерилизации подходит для термолабильных веществ, в том числе липосом,так как не включает какой-либо формы нагревания и условий, которые могутприводить к образованию продуктов деградации или утечке липосомальногосодержимого. Однако, в ряде случаев при работе с липосомами размеромболее 0,2 мкм, например, в случае липосомальных вакцин, стерилизующаяфильтрация неприемлема [156, 174].64Традиционные термические методы стерилизации не подходят,поскольку приводят к разрушению структуры липосом. Однако некоторыеисследователи не исключают возможность применения данных методов длястерилизации ЛЛФ.

Возможность использования термической стерилизациилипосом определяется сочетанием двух факторов: их стабильностью кокислению и термостойкостью веществ, вводимых в липосомы. Например,при тепловой стерилизации липосом, содержащих липиды с насыщеннымижирными кислотами, не обнаружено изменения физико-химических ибиологических свойств препаратов [49].В отличие от термических методов «холодная» стерилизация парамиэтиленоксидаможетбытьиспользованадлястерилизациитермочувствительных препаратов, поскольку не вызывает деградациипродукта. Кроме того, данный метод не влияет на размер везикул.

Являясьалкилирующим агентом для бактериальных белков и генетическогоматериала, этиленоксид может служить эффективным антибактериальнымсредством широкого спектра действия, он также эффективен в отношениивирусов. Необходимо отметить, что этиленоксид легко воспламеним,канцерогенен и мутагенен, и после стерилизации препараты должны бытьтщательно дегазированы [174].Наибольшее распространение получила радиационная стерилизация.Особенноданныйпроизводствеметодстерилизациилипосомальныхпрепаратов.актуаленпримасштабномРадиационнаястерилизацияпозволяет добиться гибели микроорганизмов из-за деградации ДНК иразрушения мембраны посредством образования свободных радикалов.

Ксожалению,образующиесяприγ-облучениирадикалынетолькоинактивируют микроорганизмы в стерилизуемом препарате, но и неизбежновоздействуют также на инкапсулируемое ЛВ и липидную оболочку мембран,вызывая перекисное окисление ненасыщенных ФЛ. Поэтому для выбора65условий стерилизации с наименьшим нарушением свойств ЛП требуетсяизучение роли этих процессов [15].Применение новейшего метода с использованием сжиженного газа приполучении липосом исключает необходимость в конечной стерилизации. Вданном методе вместо растворения липидных компонентов в органическомрастворителе, который может быть потенциальным источником микробнойконтаминации, используется сверхкритическая жидкость.

Полученныйраствор затем смешивается с водным компонентом, и сверхкритическийрастворитель выпаривается после снижения давления. Этот прогрессивныйметод позволяет получить липосомы диаметром до 1,5 мкм. В качестве газаприменяют СО2, обладающий рядом преимуществ: он невоспламеним инетоксичен,имеетотносительнонизкоетемпературу (60°С), необходимые длядавление(200-300бар)ифазового перехода, обладаетантибактериальными свойствами и низкой стоимостью [174].1.2.7. Лиофилизация липосомОсновной недостаток ЛЛФ – относительно низкая стабильностьлипосом в водной дисперсии в течение длительного периода времени, чтообусловлено разрушением липидных везикул вследствие химических(перекисное окисление и гидролиз липидов) и физических процессов(слияние, агрегация, преципитация) [174].Перспективным направлением стабилизации липосомальной дисперсииявляется метод сублимационной сушки.

Этот метод позволяет сохранитьосновные биологические свойства материалов и широко используется впроизводстве липосомальных ЛП [46, 90, 120, 156].Сублимационная(лиофильная)сушка–сушкаматериаловвзамороженном состоянии при пониженном давлении. При таком методесушки устранение влаги из материала происходит путем сублимации, т.е.перехода из твердого состояния в газообразное, минуя жидкое. Полученныелиофильной (от греч. lyo растворять + phileo любить, иметь склонность)66сушкой порошки гигроскопичны и легко растворимы.

Процесс сублимациисостоит из трех стадий – предварительного замораживания, сублимации льдаи удаления пара (первичная сушка), удаления связанной влаги притемпературе выше 0°С (вторичная сушка) [67].Замораживание является ключевой стадией процесса лиофилизации,определяющейформированиекристалловльдаиморфологиюзамороженного материала.

Первичная сушка в основном позволяет удалитьсвободную воду, тогда как вторичная сушка – связанную, что обеспечиваетотсутствие остаточной влаги в лиофилизате. Замораживание характеризуетсятакими основными факторами как скорость и температура замораживания, атакже скорость формирования льда.

Замораживание может быть быстрым имедленным [5].Стадию замораживания следует проводить с учетом индивидуальныхдля каждого вещества эвтектических температур (Тэ). Тэ – наименьшаятемпература, при которой происходит кристаллизация (замораживание)подлежащеговысушиваниюматериала.УстановлениеТэлабильныхпрепаратов обязательно, так как позволяет определить допустимуютемпературу нагревания при высушивании [67].ПрименениелиофилизациидляповышениястабильностиЛЛФосновано на предотвращении гидролиза как липосомальных ФЛ, так илабильныхЛВ,апроцессыхимическойифизическойдеградациисдерживаются низкой подвижностью липидов в твердой фазе.

К сожалению,сама лиофилизация может приводить к разрушению бислойной мембранылипосом, поэтому необходимо проводить ее в определенном режиме и сдобавлением вспомогательных веществ (криопротекторов), обеспечивающихсохранение бислойных структур [170]. Криопротектор защищает липосомыот повреждения кристаллами льда при замораживании, а также ингибируетих слияние и агрегацию. Добавление криопротектора в водную фазулипосомальной дисперсии до замораживания с последующей сублимацией67позволяет предупредить фазовое разделение липидной композиции ипредохранить инкапсулированное ЛВ от вытекания, а также сохранитьспособность липосом к регидратации [5].

В качестве криопротекторов прилиофилизации липосом наиболее часто используют полимеры (коллидон,ПВП, ПЭГ) и углеводы (сахароза, маннит, лактоза, трегалоза и др.) [4].Проведение процесса лиофилизации определяется рядом факторов:величиной,зарядомифосфолипиднымсоставомлипосом,физико-химическими свойствами вводимого в них вещества, структурой бислоя идругими факторами. По этой причине режим лиофилизации для каждогопрепарата необходимо подбирать индивидуально [49].1.2.8.

Контроль качества ЛЛФКачественные показатели можно разделить на три группы:I–показатели,характеризующиеиндивидуальныесвойствадействующих и вспомогательных веществ;II – показатели качества, характеризующие готовую форму препарата(стерильность, величина рН, токсичность, пирогенность);III – показатели, хаактеризующие свойства липосом (включение ЛВ,размер везикул, дзета-потенциал и др.) [51].Испытания должны затрагивать те свойства продукта, которыеподвержены изменениям при хранении и могут влиять на качество готовогопрепарата, причем методы количественного определения должны позволятьхарактеризовать стабильность.Особое внимание необходимо уделять структуре и свойствам новыхпродуктов, образующихся при деградации (разложении) компонентовпрепарата. В этом случае новые продукты разложения необходимоквалифицировать. Так, например, должны быть идентифицированы иуказаны граничные количества образующихся примесей, например, дляфосфатидилхолина (лизопродукты или свободные жирные кислоты) [50].68Испытания должны указать на те свойства, которые подверженыизменению при технологии получения препаратов или при их хранении имогут влиять на качество липосомальных препаратов, их эффективность ибезопасность применения.