Диссертация (Исследования по разработке и стандартизации комплексного урологического растительного средства), страница 22

Получение водного извлечения и хроматографическоеисследование проводили по выше приведенным методикам (глава 2, п. 2.3.3).Результаты хроматографического анализа исследуемого водного извлеченияэкстракта сухого представлены на рис. 4.3.3.2.4 и в табл. 4.3.3.2.5.159mV2000янтарная к-та15000ch20 1234567н500фруктозаглюкозащавеливая к-тарамнозан10008910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30минРис. 4.3.3.2.4 ВЭЖХ-хроматограмма сахаров и органических кислот водногоизвлечения экстракта сухого изучаемого сбораТаблица 4.3.3.2.5Компонентный состав моносахаридов и органических кислот экстракта сухогоизучаемого сбора методом ВЭЖХ№1.2.3.4.5.6.7.Время,мин4,3844,755,2676,3766,9628,64314,25Высота,mV244,13228,18173,62128,82136,69717,7568,66Площадь,mV*сек9139,534886.259747,493875,834279,1867186,2612964,62НазваниеЩавелевая к-таРамнозаНеидентифицФруктозаГлюкозаЯнтарная к-таНеидентифиц.Как видно из табл.

4.3.3.2.5 в водном извлечении экстракта сухого былиобнаружены такие же соединения органических кислот (янтарная, щавелевая) исвободных сахаров (рамноза, глюкоза), как и в сборе, а также былидентифицирован моносахарид – фруктоза.Таким образом, на основании полученных данных, можно заключить, что покачественному составу обнаружен полный переход БАВ из сбора в экстракт, что всвою очередь подтверждает рациональность разработанной ранее схемы полученияэкстракта сухого.1604.4 Разработка методики количественного определения суммы флавоноидовв экстракте сухомОпределение содержания суммы флавоноидов в экстракте сухом проводилина основе методики разработанной для исходного сбора.

Поскольку максимумыпоглощения комплексов 70% спиртовых растворов экстракта сухого и лютеолин7-гликозида с раствором алюминия хлорида находятся в одной области 402±5 нм,то в качестве стандартного образца использовали СО лютеолин-7-гликозид (рис.4.4.1).(1)(2)Рис. 4.4.1 Спектры поглощения комплексов спиртового извлечения «Фитоурол»экстракта сухого (1) и раствора стандартного образца лютеолин-7-гликозида сраствором алюминия хлорида (2)Методика.Точную навеску экстракта сухого массой 2,0 г помещают в колбу (объемом150 мл), прибавляют 50 мл 70% этилового спирта.

Колбу оставляют навибрационном встряхивателе на 30 мин, далее помещают в ультразвуковую банюна 20 мин. Для отделения нерастворившихся частиц экстракта от полученногораствора проводяти фильтрование через фильтровальную бумагу в мерную колбувместимостью 100 мл. Полученный объем раствора доводят до меткисоответствующим растворителем – 70% этиловым спиртом (раствор А).161В мерную колбу (объемом 25 мл) отмеряют 1,0 мл раствора А, добавляют 2мл 2% раствора алюминия хлорида (III) и полученный объем доводят до метки 70%этиловым спиртом.Раствор сравнения: в мерную колбу (объемом 25 мл) отмеряют 1 мл раствораА, добавляют 0,1 мл разведенной уксусной кислоты и доводят до метки – 95%этиловым спиртом (раствор должен быть свежеприготовленным).Оптическуюплотностьполученныхрастворовизмеряютнасаморегистрирующем спектрофотометре «Helios Alfa» (Spectronic Unicam,Великобритания) через 40 минут при длине волны 402±5 нм в кювете с толщинойслоя 10 мм.Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО лютеолин-7гликозида (при длине волны 402±5 нм): 1,0 мл СО лютеолин-7-гликозида отмеряютв колбу (объемом 25 мл), добавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида (III),полученный объем доводят до метки 70% этиловым спиртом.

В качестве растворасравнения используют раствор, содержащий 1,0 мл СО лютеолин-7-гликозида, 0,1мл разведенной уксусной кислоты и 95% этиловый спирт до 25 мл.Содержание суммы флавоноидов в экстракте сухом в пересчете на лютеолин7-гликозид в процентах (Х) вычисляют по формуле (1):(1)гдеD* – оптическая плотность испытуемого раствора;D – оптическая плотность СО лютеолин-7-гликозида;М* – масса экстракта сухого, г;М – масса СО лютеолин-7-гликозида, г;W – потеря в массе при высушивании экстракта сухого, %.Приготовление раствора стандартного образца лютеолин-7-гликозида:точную навеску СО лютеолин-7-гликозида (массой 0,03 г) помещают в мернуюколбу (объемом 100 мл), растворяют в 50 мл 70% этанола и доводят тем жерастворителем до метки – 70% этиловым спиртом, перемешивают.1624.4.1 Валидация методики количественного определения суммы флавоноидовв экстракте сухомМетодика количественного определения суммы флавоноидов в экстрактесухом валидирована по критериям: правильность, прецизионность (сходимость ивоспроизводимость), специфичность, линейность [6, 5, 25, 28, 184, 188].Правильность методики устанавливали путем проверки метода намодельных растворах СО лютеолин-7-гликозида.

Модельные растворы готовилитрёх концентраций с содержанием лютеолин-7-гликозида в % к исходнойконцентрации 80%, 100%, 120%. Исходная концентрация лютеолин-7-гликозидасоставляла 0,4 мг в 25 мл. Определение проводилось в трёх повторностях длякаждойконцентрации.Критериемприемлемостиявлялсясредний%восстановления при использовании растворов концентраций 80%, 100%, 120%,скорректированный на 100% и его средняя величина должна находиться в пределах98,0-102,0%.Согласно нашим результатам % восстановления находился в пределах от99,49% до 101,99%, и его средняя величина составила – 99,93% (табл.

4.4.1.1).Таблица 4.4.1.1Результаты проверки правильности методики№11.1.11.21.3среднее2.2.12.22.3среднееРеальное значениеизмеряемой величины вмодельной смеси в мг20,32Экспериментально найденное значениеАбсолютнаяПроцентвеличина, мгвосстановления, %340,3230,3190,316100,999,5798,7799,750,3940,4020,40898,49100,43101,99100,30,4163Продолжение таблицы 4.4.1.113.3.13.23.3среднееСредний процентвосстановлениядля 3-хконцентраций втрёхповторностях20,48340,4850,4750,401101,0298,9100,2999,7499,93Определение сходимости проводили в разные дни с использованиемспектрофотометра ««Helios Alfa»» (Spectronic Unicam, Великобритания) одним итем же специалистом на одном образце экстракта сухого в 6 повторностях ссодержанием суммы флавоноидов в пересчёте на лютеолин-7-гликозид 3,3%.Оценка сходимости проводилась по коэффициенту вариации (CV).

Согласнонашим результатам CV находится в интервале от 1,56% до 1,6%. Критериемприемлемости являлся коэффициент вариации для 6 измерений, который долженбыть не более 2%. Он составил 1,6% (табл. 4.4.1.2).Таблица 4.4.1.2Результаты проверки сходимости методикиДатаиспытаний11-ый деньСбор изучаемый с содержанием суммы флавоноидов в пересчете налютеолин-7-гликозид 0,43%РезультатыСтандартноеКоэффициент№определенияотклонение Sвариации CV, %2345123456Среднее3,23,33,33,33,33,23,270,005161,56164Продолжение таблицы 4.4.1.212-ой день23451234563,33,33,23,23,23,23,230,005161,26СреднееВоспроизводимость устанавливали по результатам анализа одного образцаэкстракта сухого в двух лабораториях в 6 повторностях с содержанием суммыфлавоноидов в пересчёте на лютеолин-7-гликозид 3,3%. Критерий приемлемостивыражался величиной коэффициента вариации для 6 измерений, который долженбыть не более 2%.

Он составил 1,25% (табл. 4.4.1.3).Таблица 4.4.1.3Результаты проверки воспроизводимости методикиЛаборатория1.Среднее2.Экстракт сухой с содержанием суммы флавоноидов в пересчете налютеолин-7-гликозид 3,3%РезультатыСтандартноеКоэффициент№определенияотклонение Sвариации CV, %13,2023,3033,3043,3053,2563,253,270,04081,25123456Среднее3,253,253,253,203,203,303,240,03761,16165Определение линейности проводили на пяти концентрациях СО лютеолин-7гликозида. Для анализа отвешивали точную навеску 0,02 г СО лютеолин-7гликозида помещали в мерную колбу (объемом 25 мл), прибавляли 20 мл 70%спирта этилового и доводили объем раствора тем же спиртом до метки (раствор А).Далее в пять мерных колб вместимостью 25 мл вносили по 1 мл; 2 мл; 3 мл; 4 мл; 5мл раствора А. К растворам во всех пяти колбах прибавляли 2 мл 2% раствораалюминия хлорида (III) и доводили до метки 70% спиртом этиловым,перемешивали.

Оптическую плотность каждого из полученных растворовизмеряли на саморегистрирующем спектрофотометре «Helios Alfa» (SpectronicUnicam, Великобритания) при длине волны 402±5 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. Критерием приемлемости линейности являлся коэффициент корреляции,величина которого между рядом полученных значений должна быть не ниже 0,98,и совокупность данных можно описать прямой линией. В эксперименте линейностьметода наблюдается в интервале концентраций 0,32-1,6 мг%, что подтверждаетсявысоким коэффициентом корреляции (r=0,999) (табл. 4.4.1.4, рис. 4.4.1.5).Таблица 4.4.1.4Результаты проверки линейности методикиОптическаяплотность DКонцентрация СО лютеолин7-гликозида, мг %Коэффициенткорреляции0,1320,2600,3800,5100,6440,320,640,961,281,600,999y=b×x+aba0,3980,003166Рис.

4.4.1.5 График зависимости оптической плотности от концентраций СОлютеолин-7-гликозидаСпецифичность методики подтверждали доказательством того, чтоспособность к светопоглощению флавоноидов при определенной длине волны,сравнивается с аналогичной способностью стандартного образца. По методикеколичественного определения суммы флавоноидов были получены окрашенныекомплексы экстракта сухого и СО лютеолин-7-гликозида.

Спектры поглощенияполученных комплексов снимали на саморегистрирующем спектрофотометре«Helios Alfa» (Spectronic Unicam, Великобритания) в интервале длин волн от 350до 460 нм. Критерием приемлемости являлась идентичность спектрапоглощения СО лютеолин-7-гликозида с алюминием хлорида со спектромпоглощенияэкстрактасухогостемжекомплексообразователем.Представленные спектры поглощения (рис. 4.4.1) визуально подтверждаютидентичность, что позволяет признать специфичность удовлетворительной.Специфичность методики также была доказана методом с добавками.Испытание проводилось на одном образце экстракта в 3-х концентрациях сдобавками СО лютеолин-7-гликозида.

Критерием приемлемости являласьвеличина относительной ошибки опытов с добавками, которая должнанаходиться в пределах случайной ошибки методики. Величина относительнойошибки опытов с добавками находится в пределах случайной ошибки методики,что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки при определениисуммы флавоноидов и о специфичности данной методики (табл. 4.4.1.6 и 4.4.1.7).167Таблица 4.4.1.6Результаты проверки специфичности методики№1.2.3.ПолученноеДобавленоОжидаемоесодержаниеСодержаниеСОсодержание флавоноидовфлавоноидов лютеолин-7флавоноидов(мг)в 1 мл (мг)гликозида(мг)(среднее из 3-х(мг)определений)29,561,0030,5631,1729,561,0531,0631,8429,562,031,5630,93Ошибкаабс.,(мг)отн.,(%)+0,61+0,78-0,63+2,0+2,5-2,0Таблица 4.4.1.7Результаты проверки специфичности методикиn5f4НаР, %95t (Р,f)2,78основании_Х, %2,956результатов,2S0,0108_ΔХ0,047S0,104полученныхприоценке_E, %4,39методикиколичественного определения суммы флавоноидов в пересчёте на лютеолин-7гликозид в экстракте сухом изучаемого сбора, можно оценить метод положительнопо параметрам: правильность, прецизионность (сходимость и воспроизводимость),специфичность, линейность (табл.