Автореферат (Клинико-иммунологические возможности оценки активности и прогноза локального и генерализованного вариантов гранулематоза Вегенера), страница 3

Мочевой синдром у11больных ГПА в основном проявлялся гематурией и протеинурией, которые чаще встречались убольныхсобострениемГПА.Всепациентынамоментисследованияполучалииммуносупрессивную терапию, в том числе глюкокортикостероидами – 56 человек (93,3%), изних глюкокортикостероидами более 20 мг/сут – 24 (40%), циклофосфамидом – 24 (40%),метотрексатом – 11 (18,3%), азатиоприном – 9 (15,0%).Исследование нарушений синтеза цитокинов на уровне транскрипции у больных ГПАПри изучении синтеза цитокинов на уровне транскрипции у 57 больных ГПА выявилистатистически значимую (p<0,05) активацию синтеза мРНК ИФН-α, ИЛ-8 и подавление синтезамРНК ИЛ-12 и ФНО-α по сравнению с группой контроля (n=40) (табл.2)Таблица 2 - Частота выявления мРНК цитокинов у больных ГПА и здоровыхдобровольцев.ЦитокинБольные ГПА (n=57)Контроль (n=40)N (%)N (%)ИФН-α23 (40,35)*1 (2,50)ИФН-γ10 (17,54)12 (30,00)ИЛ-1β27 (47,36)14 (35,00)ИЛ-28 (14,03)0ИЛ-43 (5,26)0ИЛ-617 (29,82)8 (20,00)ИЛ-825 (43,85)*4 (10,00)ИЛ-1014 (24,56)8 (20,00)ИЛ-123 (5,26)**28 (70,00)ИЛ-1830 (52,63)12 (30,00)ФНО-α17 (29,82)**30 (75,00)Примечание: * p˂0,05, **p˂0,01 (метод Манна-Уитни)Исследование синтеза цитокинов на уровне транскрипции у больных с локальным игенерализованным ГПАСтатистически достоверная (p˂0,05)активация экспрессии генов ИФН-α, ИЛ-8 иподавление экспрессии генов ИЛ-12, ФНО-α определялась у больных с локальной формой ГПА(n=22) и генерализованной формой ГПА (n=35) по сравнению с группой контроля.

Присопоставлении цитокинового профиля у больных локальным ГПА с цитокиновым профилем12больных генерализованным ГПА статистически значимых изменений в экспрессии геновисследуемых цитокинов выявлено не было (табл. 3).Таблица 3 - Частота выявления мРНК цитокинов у больных с локальным игенерализованным ГПА по сравнению с контролем.ЦитокинЛокальный ГПА(n=22)ГенерализованныйГПА (n=35)Контроль (n=40)N (%)N (%)N (%)ИФН-α8 (36,36)*15 (42,85)**1 (2,50)ИФН-γ2 (9,09)8 (22,85)12 (30,00)ИЛ-1β11 (50,00)16 (45,71)14 (35,00)ИЛ-22 (9,09)6 (17,14)0ИЛ-41 (4,54)2 (5,71)0ИЛ-64 (18,18)13 (37,14)8 (20,00)ИЛ-811 (50,00)**14 (40,00)*4 (10,00)ИЛ-107 (31,81)7 (20,00)8 (20,00)ИЛ-122 (9,09)***1 (2,85)***28 (70,00)ИЛ-1812 (54,54)18 (51,42)12 (30,00)ФНО-α5 (22,72)***12 (34,28)**30 (75,00)Примечание: * p˂0,05, ** p˂0,01, *** p˂0,001 (метод Манна-Уитни; сравнение с группойконтроля)Сравнение цитокинового профиля у больных с локальным и генерализованным ГПА сучетом периода течения заболевания.

При сопоставлении цитокинового профиля у больных собострением локального ГПА с цитокиновым профилем больных с ремиссией локального ГПАстатистически значимых изменений в экспрессии генов исследуемых цитокинов выявлено небыло.Также не было обнаружено достоверных отличий в экспрессии генов исследуемыхцитокинов у больных с обострением генерализованного ГПА с цитокиновым профилем больныхс ремиссией генерализованного ГПА.Исследование синтеза цитокинов на уровне транскрипции у больных с обострением иремиссией ГПАПри анализе цитокинового профиля больных с обострением и ремиссией ГПА былоустановлено, что при сравнении этих групп с группой контроля определяется активацияэкспрессии генов ИФН-α, ИЛ-8 и подавление экспрессии генов ИЛ-12, ФНО-α.

Кроме того, убольных с обострением ГПА отмечается статистически значимая активация экспрессии генаИЛ-18 по сравнению с группой контроля. При сопоставлении цитокинового профиля у больных13с обострением ГПА с цитокиновым профилем больных с ремиссией ГПА статистическизначимых изменений в экспрессии генов исследуемых цитокинов выявлено не было (табл. 4).Таблица 4 - Частота выявления мРНК цитокинов у больных с обострением и ремиссиейГПА и здоровыми добровольцами.Обострение ГПА(n=29)Ремиссия ГПА(n=28)Контроль (n=40)N (%)N (%)N (%)ИФН-α14 (48,27)**9 (32,14)*1 (2,50)ИФН-γ5 (17,24)5 (17,85)12 (30,00)ИЛ-1β13 (44,82)14 (50,00)14 (35,00)ИЛ-24 (13,79)4 (14,28)0ИЛ-41 (3,44)2 (7,14)0ИЛ-69 (31,03)8 (28,57)8 (20,00)ИЛ-814 (48,27)**11 (39,28)*4 (10,00)ИЛ-107 (24,13)7 (25,00)8 (20,00)ИЛ-122 (6,89)***1 (3,57)***28 (70,00)ИЛ-1819 (65,51)*11 (39,28)12 (30,00)ФНО-α10 (34,48)**7 (25,00)***30 (75,00)Цитокин*p < 0,01 ** p < 0,001 *** p˂0,001(метод Манна-Уитни; сравнение с группой контроля)Для определения возможности использовать мРНК ИЛ-18 в качестве дополнительногопоказателя активности ГПА, определена специфичность и чувствительность данного метода.Проведен ROC-анализ (риc.

1).14Рисунок 1 - Чувствительность и специфичность определения мРНК ИЛ-18 в МПК убольных с обострением ГПА (ROC-анализ).Площадь под кривой составила 0,67. Проведенный ROC-анализ продемонстрировал, чточувствительность данного метода составляет -75%, специфичность - 41%.Сравнение цитокинового профиля у больных с обострением и ремиссией ГПА с учетомформызаболевания. При сопоставлении цитокинового профиля у больных с обострениемлокального ГПА с цитокиновым профилем больных с обострением генерализованного ГПАстатистически значимых изменений в экспрессии генов исследуемых цитокинов выявлено небыло. Также не было определено достоверных отличий в экспрессии генов исследуемыхцитокинов у больных с ремиссией локального ГПА с цитокиновым профилем больных сремиссией генерализованного ГПА.Исследование содержания цитокинов в сыворотке крови больных ГПАУ 40 из 60 больных ГПА проводилось исследование содержания ИФН-α, ИЛ-1β, ИЛ-8,ИЛ-18 и ФНО-α в сыворотке крови.

При сравнении концентрации цитокинов больных ГПА снормальнымизначениями,указаннымифирмой-производителем,установлено,чтоуобследованных больных в сыворотке крови наиболее часто выявлялось повышенное содержаниеИЛ-1β (50%) и ИЛ-18 (45%), реже – ФНО-α (15%) и ИФН-α (17,5%). ИЛ-8 определяется вповышенных концентрациях у 35% больных ГПА.При изучении продукции цитокинов больных ГПА обнаружено, что уровни всехизучаемых цитокинов (ИФН-α, ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-18 , ФНО-α) в сыворотке крови были выше упациентов с обострением ГПА, чем у пациентов с ремиссией заболевания, однако статистическизначимая разница была выявлена для ИЛ-8.

У больных с обострением ГПА в сыворотке крови15достоверно чаще (p˂0,01) определялось повышение содержания ИЛ-8 по сравнению с больнымив ремиссии заболевания (табл. 5, рис. 2).Таблица 5 - Сравнение средних значений содержания цитокинов в сывоторки крови убольных с обострением и ремиссей ГПА.ЦитокинОбострение ГПА (n=23), пг/млРемиссия ГПА (n=17),пг/млИФН-α11,03±12,147,63±10,84ИЛ-1β74,84±104,0136,54±61,53ИЛ-818,53±42,20*8,24±4,22*ИЛ-18359,24±293,66303,86±241,52ФНО-α11,20±23,501,00±0,00* p˂0,05 (метод Вальда-Вольфовитца)Рис.

2 - Уровень ИЛ-8 в сыворотке крови у больных с ремиссией и обострением ГПА.Для определения возможности использования ИЛ-8 в качестве дополнительногопоказателя активности ГПА, была определена специфичность и чувствительность данногометода. Проведен ROC анализ. Определены оптимальные значения чувствительности испецифичности, которые составляют 65,2 и 64,7% соответственно при концентрации ИЛ-8 всыворотке крови более 6,3 пг/мл. Площадь под ROC-кривой составляет 0,54. (рис. 3).16ИЛ-8100Чувствительность806040200020406080100-Специфичность100Рисунок 3 - Чувствительность и специфичность определения ИЛ-8 в сыворотки крови убольных с обострением ГПА (ROC - анализ)Оценка продукции цитокинов у больных локальной и генерализованной формами ГПАПри сравнении средних значений содержания цитокинов в сыворотки крови больных слокальной и генерализованной формами заболевания, отмечено, что уровни всех изучаемыхцитокинов (ИФН-α, ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-18 , ФНО-α) в сыворотке крови были выше у пациентов сгенерализованной формой ГПА, чем у пациентов с локальным ГПА, однако статистическизначимая разница была выявлена для интерлейкина-18 (табл.

6). У больных с генерализованнойформой заболевания уровень ИЛ-18 достоверно выше (p˂0,05)., чем у больных с локальнойформой заболевания (рис. 4).Таблица 6 - Сравнение средних значений содержания цитокинов в сывоторки кровиу больных с локальным и генерализованным ГПА.ЦитокинЛокальный ГПА (n=17), пг/млГенерализованный ГПА(n=23), пг/млИФН-α8,08±6,8710,7±14,16ИЛ-1β49,22±77,2065,47±98,85ИЛ-88,08±3,7918,64±42,20ИЛ-18237,75±142,75 **408,09±319,86 **ФНО-α1,24±0,9911,02±23,56** (p˂0,05) (метод Колмогорова-Смирнова).ИЛ817Box Plot of il-18; categorized by formaSpreadsheet1 10v*40cпг/мл800700ИЛ-18 пг/млil-18600500400300Среднее200Среднее+ошибка среднего100Среднее+стандартное отклонение0forma: 1forma: 2Локальный ГПАMeanMean±SEMean±SDГенерализованныйГПАРисунок 4 - Уровень ИЛ-18 в сыворотке крови у больных с локальным игенерализованным ГПА.Для оценки чувствительности и специфичности определения ИЛ-18 методом ИФА, какдополнительного показателя генерализованной формы ГПА, проведен ROC-анализ.

Наиболееоптимальные значения чувствительности и специфичности, которые составляют 60,9 и 82,4%соответственно, установлены при концентрации данного биомаркера в сыворотке кровибольных ГПА более 258,5 пг/мл. Площадь под ROC-кривой составляет 0,627 (рис. 5).ИЛ-18100Чувствительность806040200020406080100-Специфичность100Рисунок 5 - Чувствительность и специфичность определения ИЛ-18 в сывороткикрови у больных с генерализованной формой ГПА (ROC-анализ)Корреляция между клинико-лабораторными данными и цитокинами у больных ГПАПроводилось исследование корреляционной зависимости обнаружения экспрессии мРНКИФН-α, ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-α, определяемыхметодом ПЦР, и уровнями ИФН-α, ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-18 и ФНО-αв сыворотке крови,18определяемых методом ИФА, с клинико-лабораторными проявлениями болезни: поражениеморгана зрения; органа слуха; носа и придаточных пазух носа; гортани; легких, почек, а также сналичием критериев васкулита и гранулематозного воспаления.

Результаты исследованиякорреляционных связей между клинико-лабораторными проявлениями ГПА и цитокинамипредставлены в таб. 7.Таблица 7 - Коэффициенты корреляции (R) между клинико-лабораторнымиданными с одной стороны и уровнем экспрессии мРНК цитокинов в МПК и содержаниемПоражениелегкихПоражениепочкиПоражениегортаньПоражениеорганаслухаПоражениеглазИФН-α0,170,010,16-0,33-0,08 -0,200,30-0,36*ИФН-γ0,28-0,371,000,020,38-1,00*0,57*0,11ИЛ-1β0,230,02-0,400,240,05-0,020,120,10ИЛ-20,270,04-0,540,31-0,10 -0,470,450,38ИЛ-40,55-0,73*-0,86*-0,331,00* -1,000,230,43ИЛ-60,40-0,11-0,090,110,13-0,57*0,41*0,36ИЛ-80,20-0,080,23-0,320,200,25-0,01-0,20ИЛ-10-0,08-0,48*1,000,39-0,30 0,08-0,16-0,07ИЛ-12-0,12-0,17-0,86*-1,00*1,00* -1,00-0,46-0,27ИЛ-180,350,63*0,400,17-0,19 -0,330,160,05ФНО-α0,25-0,311,00-0,06-0,04 -0,330,41*0,04ПризнакиваскулитаПоражениеноса иППНПризнакигранулематозногопораженияцитокинов в сыворотке с другой стороны у больных ГПА.Транскрипция цитокиновПродукция цитокиновИФН-α0,74*1,00-0,68*-0,050,130,010,110,10ИЛ-1β0,170,02-0,11-0,070,05-0,26-0,010,05ИЛ-80,22-0,110,01-0,140,19-0,330,070,24ИЛ-180,22-0,29-0,03-0,34*0,40* -0,55*0,32*0,17ФНО-α0,66*1,001,000,000,110,430,290,04* p ˂ 0,05 (метод гамма корреляции)По данным проведенного исследования обнаружено, что наличие признаков васкулитадостоверно коррелировало с повышением уровня ИФН-α (r=0,74) и ФНО-α (r=0,66) в сывороткекрови больных ГПА.