Автореферат (Клинико-иммунологические возможности оценки активности и прогноза локального и генерализованного вариантов гранулематоза Вегенера), страница 2

Признаки васкулита у больных ГПА коррелируют с повышением продукции ИФН-α иФНО-α, а признаки гранулематозного воспаления, поражение носа и придаточных пазух - сподавлением экспрессии генов ИЛ-4.Методология и методы исследованияТеоретической базой проведенной диссертационной работы являлись работы зарубежныхавторов,вкоторыхпоказаныпротиворечивыеданныеомеханизмахразвитияиммуновоспалительного процесса и методов оценки активности и распространенности ГПА, атакже неполное изучение вопроса изменения цитокинов только у больных с гранулематозом сполиангиитом. В отечественных работах не проводилось изучение цитокинов-маркеров:активности, наличия генерализованной формы заболевания.

Отсутствовали данные оцитокинах-предикторах обострения, а также взаимосвязь обнаружения тех или иных цитокиновпри поражении определенных органов и систем. Перечисленные обстоятельства стали основойдля последующего изучения данной проблемы. Методологической базой является применениеметодов диагностики: ОТ-ПЦР для определения транскрипции генов цитокинов в МПК и ИФАдля определение содержания цитокинов в сыворотке крови больных ГПА. Оценка активности ираспространенности заболевания проводилась на основании данных клинической картинызаболевания, шкал BVAS и VDI, лабораторно-диагностических методов обследования.Степень достоверности и апробация результатовВ ходе выполнения данной работы применялось сертифицированное лабораторноеоборудование и современные методы обследования пациентов, в результате чего получензначительный объем экспериментальных данных.

Анализ полученных данных проводился всоответствии с адекватными общепринятыми методами и критериями статистическойобработки. Методы исследования выбраны в соответствии с поставленными целями и задачами.Положения, выносимые на защиту, выводы и рекомендации основаны на результатахисследования, достоверность которых подтверждена актом проверки первичной документации.Апробация работы проведена 15 февраля 2018 года на заседании сотрудников кафедрывнутренних, профессиональных болезней и пульмонологии ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им.И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет).7Личный вклад автораВклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: отпостановки задач, их теоретической и практической реализации до обсуждения результатов внаучных публикациях и их внедрения в практику.Внедрение результатов в практикуРезультаты используются в работе ревматологического отделений клиники нефрологии,внутренних и профессиональных болезней им.

Е.М. Тареева Университетской клиническойбольницы №3 и кафедры внутренних, профессиональных болезней и ревматологии медикопрофилактического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России(Сеченовский Университет).Соответствие паспорту научной специальностиНаучные положения и результаты исследования соответствуют формуле специальности 14.01.04– "внутренние болезни" и пунктам: №2, №3 и №5, а также формуле специальности 14.03.09 "клиническая иммунология, аллергология" и области исследования специальности: изучениепатогенеза иммунозависимых заболеваний (иммунодефицитных состояний, аллергической иаутоиммунной патологии), разработка и усовершенствование методов диагностики ипрофилактики аллергических и иммунопатологических процессов.ПубликацииПо теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 в журналах,рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 6 - в зарубежных изданиях.

Материалыдиссертации представлены на ANCA Workshop (Лондон, 2015 (постерный доклад); Токио, 2017(2 постерных доклада)), EULAR (Мадрид, 2013 (постерный доклад); Рим, 2015 (постерныйдоклад))Объем и структура диссертацииДиссертация изложена на 126 страницах печатного текста и состоит из введения, обзоралитературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственногоисследования, их обсуждения, выводов и практических рекомендаций, содержит 5 рисунков и28 таблиц. Список литературы содержит 106 источников, из них 37 отечественных.Клиническое исследование проводилось на базе кафедры внутренних, профессиональныхболезней и пульмонологии медико-профилактического факультета (с 01.04.2018 - кафедравнутренних, профессиональных болезней и ревматологии) в клинике нефрологии, внутренних ипрофессиональных болезней им.

Е.М. Тареева УКБ №3 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова8Минздрава России (Сеченовский Университет) (заведующий кафедрой и директор клиники –доктор медицинских наук - Моисеев С.В.).СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИМатериалы и методы исследованияВ исследование включали пациентов с ГПА, установленным в соответствии с критериямиАмериканской коллегии ревматологов 1990 года и номенклатурой, принятой в 2012 году наконференции в Чапел-Хилл (США). Для оценки активности использовали шкалу BVAS(Бермингемский индекс активности васкулита).

[Suppiah R., 2011]Ремиссией заболеваниясчиталось наличие 1 и менее баллов по шкале BVAS, обострением ГПА - 2 и более баллов пошкале BVAS. У всех больных проводилась оценка органных поражений с использованиеминдекса VDI. [Exley A.R.,1997] При анализе течения болезни выделяли локальный (поражениеверхних дыхательных путей, органа зрения и слуха) и генерализованный (поражение верхнихдыхательных путей, органа зрения и слуха в сочетании с поражением легких и/или почек, атакже желудочно-кишечного тракта, нервной системы, кожи) варианты ГПА.

У всех больныхоценивали наличие признаков васкулита и/или гранулематоза. [Watts R., 2007; Новиков П.И.,2014; Бекетова Т.В., 2012]Определение мРНК 11 цитокинов в мононуклеарах периферической крови (МПК)методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) провели у 57больных ГПА. Выделение РНК проводили по методике [Chomczynski P., Sacchu N., 1987] сиспользованием набора для выделения научно-производственной компании СИНТОЛ. Обратнаятранскрипция ипредложеннойПЦР-амплификация были выполненыС.Gelder.ПослеамплификациивсоответствиипродуктыПЦРс методикой,анализировалиэлектрофоретически в 1% агарозном геле.

В качестве положительного контроля использовалиβ-актин. Электрофорез кДНК проводили в 1% агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мкг/мл)вТрис-ацетатномбуфере,содержащем0,2МЭДТА.Электрофорезпроводилсявгоризонтальных камерах фирмы «Bio-Rad» 20 минут. Для идентификации нуклеотидныхпоследовательностей использовали маркер для электрофореза фирмы Promega (G 1758). [Ершов,2002]. Группу контролясоставляли данные экспрессии мРНК 11 цитокинов в МПК,полученных у 40 здоровых доноров.Содержание цитокинов в сыворотки крови определяли у 40 больных ГПА. ПроводилосьисследованиеИНФ-α,ИЛ-8,ИЛ-18,ИЛ-1βиФНО-αсиспользованемметодаиммуноферментного анализа (ИФА).

Для количественного определения содержания цитокинов9использовали коммерческие наборы для ИФА ЗАО «Вектор-Бест» по методике, представленнойфирмой-производителем.Статистический анализ.Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica версии 10.0.Учитывая, что результаты исследования с использованием метода ОТ-ПЦР представляют собойкачественные показатели, оценку значимости различий в группах проводили с использованиемнепараметрического критерия Манна-Уитни. Для обработки результатов исследованияцитокиновсиспользованиемметодаИФАприменялинепараметрическиеметодыстатистического анализа, а именно критерий Вальда- Вольфовица и критерий КолмогороваСмирнова.

Для расчета показателей диагностической эффективности метода проводилосьпостроение ROC-кривых. Исследование корреляционной связи проводили с использованиемнепараметрического метода статистического анализа – гамма-корреляции. Для оценки связимежду развитием обострения ГПА в течение одного года и наличием фактора риска (измененияцитокинов) проводилось статистическое исследование c применением метода отношенияшансов. Р<0,05 указывало на статистическую значимость.РезультатыКлиническая характеристика обследованных больных ГПАОбследовано 60 больных (21 мужчина и 39 женщин) с установленным диагнозом ГПА.Средний возраст обследованных больных составлял 48,9±15,6 лет.

Для подтверждения диагнозаГПА у 40 (66,7%) больных была выполнена биопсия. У 22 из 60 больных была выявленалокальная форма ГПА (поражение верхних дыхательных путей, органа слуха и зрения). У 38больных определялась генерализованная форма ГПА с поражением верхних дыхательных путей,органа зрения, слуха в сочетании с поражением легких и/или почек. Среднее значение BVASсоставило 2,7 баллов. Минимальное значение – 0 баллов, максимальное – 18 баллов. У 32больных определялось 2 и более баллов по шкале BVAS, что расценивалось как обострениезаболевания (медиана возрасту – 51,5 лет).

Ремиссия ГПА была установлена у 28 больных(медиана возраста – 49,5 лет). Среднее значение индекса VDI составило 11,35±5,06. У 46 (76,7%)больных ГПА определялись АНЦА, причем у 36 (60,0%) пациентов были обнаружены АНЦА кпротеинезе 3, а у 10 (16,7%) – АНЦА к миелопероксидазе.Клиническими эквивалентами гранулематозного воспаления у больных ГПА являются:гранулематозное воспаление при биопсии, инфильтраты/узлы в легких, подскладочный стенозгортани или трахеи, язвенно-некротический ринит с формированием перфорация носовойперегородки, деструктивный синусит, псевдотумор орбиты, утолщение слизистой придаточныхпазух носа (длительностью не менее 3 мес.), мастоидит (длительностью не менее 3 мес).10Клиническими признаками васкулита являются кожные геморрагические или язвенногеморрагические высыпания, эписклерит, множественный мононеврит, гломерулонефрит,протекающий с гематурией, чаще в сочетании с умеренной протеинурией [Watts R., 2007].Наиболее часто, в 95,0% случаев, у больных ГПА определялось поражение носа ипридаточных пазух.

Более половины обследованных больных имели поражение легких (58,3%),у 46,7% - наблюдалось поражение почек в рамках васкулита. Признаки васкулита быливыявлены у 34 (56,7%) пациентов, признаки гранулематозного воспаления – у 45 (75,0%)больных. Частота поражения органов, развития признаков гранулематозного воспаления иваскулита в зависимости от наличия обострения или ремиссии заболевания, локальной илигенерализованной формы ГПА представлена в табл. 1.Таблица 1 - Поражение органов, наличие признаков гранулематозного воспаления иваскулита у больных с различной формой и периодом заболевания.VDIОбщееФорма заболеванияПериод заболеванияN=60Локальная(n=22)Генерализованная (n=38)Обострение(n=32)Ремиссия(n=28)7,27±2,6213, 71±4,6812,13±5,2810,46±4,8211,35±5,06Поражениеоргана зрения33 (55,0%)12 (54,5%)21 (55,3%)13 (40,6%)20 (71,4%)Поражениеоргана слуха29 (48,3%)8 (36,4%)21 (55,3%)12 (37,5%)17 (60,7%)Поражениеноса,придаточныхпазух носа57 (95,0%)20 (90,9%)37 (97,4%)32 (100,0%)25 (89,3%)Поражениегортани16 (26,7%)7 (31,8%)9 (23,7%)8 (25,0%)8 (28,6%)Поражениелегких35 (58,3%)035 (92,1%)22 (68,8%)13 (46,4%)Поражениепочек28 (46,7%)028 (73,7%)14 (43,8%)14 (50,0%)Признакиваскулита34 (56,7%)3 (13,6%)31 (81,5%)19 (59,4%)15 (53,6%)Признакигранулематозноговоспаления45 (75,0%)19 (86,4%)26 (68,4%)29 (90,6%)16(57,1%)У больных с обострением ГПА по сравнению с больными, в ремиссии ГПА наиболеечасто встречалось повышение содержания СОЭ и С-реактивного белка.