Диссертация (Клинико-патогенетические особенности патологических процессов шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией), страница 10

Процедура можетвыполняться под местной анестезией.Деструктивные методы лечения проводились аппаратом PlasmaJeT® (GreatBritain). Суть работы данной хирургической системы заключается в воздействиивысокотемпературнойплазмы на ткани, для получения которого используетсяинертный газ аргон Аргон (Ar)6. Через редуктор Аргон ВЧ поступает в консоль,где расположен блок управления подачей газа в рабочий инструмент.

Внутрирабочего инструмента (манипулятора-плазматрона) расположен запатентованныймногоэлектродный пакет, который ионизирует поступающий газ Аргон, чтопозволяет использовать инструмент и как манипулятор в ране, без пригораниятканей к поверхности инструмента. Образующаяся при этом плазма достигаеттемпературы до 24000 К (23726.85 °C). Создаваемый пламенный поток обладает3 видами энергии, в соответствии с которыми происходит: диссекция, аблация ивыпаривание биологической ткани.Ультразвуковое исследование (УЗИ) осуществляли при обращении и впроцессе обследования и лечения от 3 до 7 раз. УЗИ выполнялось на аппаратах«Acuson 128 ХР 10» (США),«Dornier АI 5200» (Германия) и «Logiq C5» (USA) сприменениемтрансабдоминальногоконвексного(частота3,5МГц)итрансвагинального (частота 6,5 и 7 МГц) датчиков, позволяющих сочетать режимсканирования в реальном времени и функцию импульсно-волнового допплера.УЗИ проводилось на 5–7-й день цикла и за 2–5 дней до предполагаемой64менструации,апринеобходимостиосуществляласьультразвуковаяфолликулометрия с интервалом 2 дня.

Полученные при УЗИ линейные размеры иобъем матки, ШМ и яичников сравнивались с общепринятыми нормативнымипоказателями. При наличии миомы матки, аденомиоза, гиперпластическогопроцессаэндометриявУЗИвходилотакжеприменениецветовогодопплеровского картирования (ЦДК) и допплеровского анализа всех исследуемыхбольных, с качественной и количественной оценкой кровотока.Дляоценкисостоянияполостиматкипроизводилосьраздельноедиагностическое выскабливание эндоцервикса и эндометрия под контролемгистероскопии с последующим патоморфологическим исследованием биоптата.Жидкостнуюгистероскопиювыполнялиспомощьюэндоскопическогооборудования фирмы «Karl Storz» (Германия) по стандартной методике, вкачестве расширяющей полость среды — стерильный изотонический раствор(500–1000 мл) хлорида натрия6.

Путем кюретажа получали раздельный соскоб изцервикального канала и полости матки.Дляморфологическойверификациипатологическогоисследованияэндометрия также проводили аспирационную биопсию эндометрия с помощьюаспирационной кюретки Pipelle de Cornier («Laboratoire C.C.D.», Франция) споследующим гистологическим исследованием биоптата. С целью исключенияхроническогоменструальногоэндометрита забор материала осуществлялицикла,адляисключенияна 5–7 деньгиперпластическогопроцессаэндометрия аспирационную биопсию эндометрия проводили во второй фаземенструального цикла.Пациенткам всех групп производилось выскабливание цервикального каналаи прицельная радиоволновая биопсия.Морфологическое исследование макропрепаратов, удаленных в ходеоперации, проводили на кафедре патологической анатомии Первого МГМУимени И.

М. Сеченова (зав. кафедрой — д.м.н., проф. Е. А. Коган) и впатологоанатомическом отделении ГКБ № 53 (зав. отделением — В.Н. Дралов).Морфологические и ИГХ методы изучения биомолекулярных маркеров с65использованием высокоспецифичных антител проводили под руководствомд.м.н., профессора Е. А. Коган.Изучали операционный материал и парафиновые срезы, полученные приприцельной биопсии, эксцизии и конизации ШМ, при раздельном выскабливанииматки и других оперативных вмешательствах на матке. Гистологические срезыокрашивали гематоксилином и эозином (обзорная окраска) и пирофуксином поВан Гизону (окраска на коллагеновые волокна), орсеином (для выявленияэластических волокон).

Биоптат фиксировали в 10% нейтральном формалине и,по общепринятой методике, после обезвоживания (проводки ткани) заливали впарафиновые блоки. Срезы ткани толщиной 4–5 мкм для дальнейшегоморфологического исследования изготавливали на микротоме Leika (Германия).Проведенное ИГХ исследование было выполнено на операционном ибиопсийном материале и включало в себя изготовление ИГХ препаратовдля световой микроскопии с целью выявления молекулярно-генетическихособенностей при патологических процессах ШМ.ИГХ реакции ставились по общепринятой методикe с демаскировкойантигенов в СВЧ-печи на серийных парафиновых срезах из ткани матки. Изпарафиновых блоков по обычной методике готовились гистологическиесрезы толщиной 4 мкм, которые фиксировались на стекла, предварительнопокрытыеадгезивом(APES-ацетон).Блокированиеэндогеннойпероксидазы проводилось 3% пероксидом водорода в депарафиновыхсрезах.

Далее проводили демаскировку антигена в СВЧ-печи в течение 20мин при 600В в растворенном цитратном буфере с рН=6,0 (табл. 2).В качестве первичных специфических антител использовалисьантитела к Ki-67-маркеру пролиферации (DАКО); p-53-маркеру пролиферации(DAKO); ДНК-метилтрансферазам (DNMT 1, DNMT 2) и гистондеацетилазам(HDAC I, HDAC II; Sigma, USA). В качестве вторичных антител ивизуализирующей системы применялся стрептавидиновый комплекс (LSAB KIT(DAKO)).66Насрезахбезспецифическихпервичныхантителставилсяотрицательный контроль реакции.

В качестве положительного контроляиспользовалсямелкоклеточныйраклегкогочеловека(с известнойэкспрессией маркеров). Результаты ИГХ реакции для p-53, DNMT 1, DNMT 2,HDAC 1, HDAC 2 оценивались в баллах полуколичественным методом попроценту окрашенных клеток.Таблица 2.Протокол ИГХ реакцииДеньПротокол11. Депарафинация: стекла сначала помещают на 5 мин в ксилол 1,затем на 5 мин в ксилол 2, затем полоскают 5 мин в ксилоле 3.2. Регидратация: полоскание стекол по 5 мин через батареюспиртов 100%, 96%, 90%, 80%, 70%; 5 мин в дистиллированной воде.3. Блокирование эндогенной пероксидазой: инкубация стекол в 3%водном растворе перекиси водорода 20 мин в холодильнике.4.

Полоскание в дистиллированной воде 2 раза по 5 мин.5. Микроволновая обработка в цитратном буфере 20 мин (600В)вместе со стаканом дистиллированной воды.6. Охлаждение стекол 15 мин.7. ПолосканиевPBS-растворе,приготовленномиз14,4гNa2HPO4*2 H2O, 80 г NaCl, 2 г KH2PO4, с ph = 7,4, 5 мин.8.

Инкубация с 20% говяжьей сывороткой 30 мин во влажнойкамере.9. Удаление альбумина.10. Инкубацияпервичнымантителом,разведеннымальбумином (по 50 мл на срез) 12 ч при температуре 4о С.211. Полоскание в холодном PBS-растворе 2 раза по 10 мин.12. Инкубация вторичным антителом 1 ч, разбавленном в 0,1%1%67растворе альбумина.13. Полоскание в PBS-растворе 2 раза по 5 мин.14. Инкубация стрептавидиновым комплексом (LSAB KIT(DAKO)).15. Полоскание в PBS-растворе 2 раза по 10 мин.16.

DAB (Vector-kit).17. Полоскание в дистиллированной воде.18. Полоскание в водопроводной воде 5 минут.19. Окраска 10% гематоксилином 7 мин.20. Полоскание в водопроводной воде 5 мин.21. Дегидратация: полоскание через батарею спиртов 70%, 80%,90%, 96%, 100%. Затем в ксилоле 3, 2, 1 по 5 мин.22. Покрытие закрепляющим раствором (Depex).Результаты ИГХ реакции оценивалисьв баллах полуколичественнымметодом по проценту окрашенных клеток, следуя нижеприведенной схеме(табл. 3).Таблица 3.Оценка интенсивности реакции.Баллы6420Обозначение++++++–Количество>40%40–Доположительных клетокклеток20% клеток20% клеток0%клеток68ОценкаэкспрессииКi-67проводиласьпутемподсчетапроцентаокрашенных ядер на 3000 клеток.2.4. Методы статистического анализаСтатистическая обработка данных выполнена на персональном компьютерес помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ«Statistica for Windows» v.

7.0, StatSoft Inc. (США).Всеполученныеколичественныеданныеобработаныметодомвариационной статистики [52]. Для каждого количественного параметра былиопределены: среднее значение, среднеквадратическое отклонение, ошибкасреднего, медиана, 95% ДИ. Для качественных данных определяли показателичастоты (%).Перед проведением сравнительного анализа количественных данных висследуемых группах определяли вид распределения данных (тест КолмогороваСмирнова). При нормальном виде распределения данных для оценки различий вгруппах применялись методы параметрической статистики (критерий Стьюдента).При отсутствии нормального распределения данных применялись методынепараметрической статистики — тест Манна-Уитни для сравнения данных вгруппах.

Показатели, изменяющиеся в динамике, оценивались с помощьюпарного критерия Вилкоксона.Длясравнениядихотомическихпоказателеймеждунезависимымивыборками и установления достоверных различий между ними использовалиметод Хи-квадрат (χ2), для вычисления которого прибегали к построению таблиц«2х2» и «3х2», Хи-квадрат с поправкой Йейтса на непрерывность, Хи-квадрат МП(максимального правдоподобия), а также точный критерий Фишера длянебольших выборок.69При невозможности применения критерия Хи-квадрат (все ожидаемыечисла >5) использовался t-критерий Стьюдента, а для 0% и 100% — с поправкойдля концевых точек.Статистически значимыми считались различия при р<0,05 (95%-й уровеньзначимости) и при р<0,01 (99%-й уровень значимости).Всеколичественныепоказателибылипроверенынасоответствиенормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка.Предполагается,чтоисследуемоераспределениенеотличаетсяотнормального распределения (нулевая гипотеза — распределения одинаковые).Если в результате получается р<0,05, то нулевая гипотеза отвергается.Соответственно, исследуемое распределение отличается от нормального.Для сравнения числовых данных (после проверки количественных данныхна нормальное распределение) использовали t-критерий Стъюдента для двухнезависимых выборок.

Для сравнения непараметрических данных применяликритерий Манна-Уитни (для двух групп) для несвязанных совокупностей.Связь между изучаемыми показателями оценивалась по результатамкорреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Пирсона (r)и/или Спирмена (R) и последующим установлением его значимости по критерию t(формула 1).Расчет коэффициента корреляции Пирсона(1)где,— среднее значение выборок.Ранговый коэффициент корреляции Спирмена рассчитывался по формуле 2:(2)70где n — количество ранжируемых признаков (показателей, испытуемых);D — разность между рангами по двум переменным для каждогоиспытуемого;D2 — сумма квадратов разностей рангов.Вработепринималасьследующаяинтерпретациякоэффициентакорреляции:До 0,3 — слабая корреляция;От 0,3 до 0,7 — умеренная корреляция;Более 0,7 — сильная корреляция.Относительный риск (ОР) заболеваемости вычисляли по методу Katz поформуле 3:ОР = (а/(а+b))/(c/(c+d)),(3)где а — количество больных, имеющих данный признак;b — количество больных, не имеющих данного признака;c — количество здоровых индивидуумов с данным признаком;d — количество здоровых индивидуумов, не имеющих данного признака.В том случае, когда один из показателей был равен 0, относительный рисквычисляли по формуле 4, модифицированной Haldane для малых чисел:[(2a+1)(2d+1)]/[(2b+1)(2c+1)](4)Статистическую достоверность отличия ОР от 1 (р) определяли по точномудвустороннему критерию Фишера для четырехполосных таблиц с поправкой наколичество выявленных аллелей/генотипов (рс); 95% ДИ (95% CI) вычисляли поформуле 5:95% CI=InOP±1,96*OP,(5)71где OP, a, b, c, d — те же показатели, что и в формуле для определения ОР.Для исследования влияния нескольких независимых переменных на однузависимую переменную использовался одномерный дискриминантный анализ —метод бинарной логистической регрессии.

При этом независимые переменныемогут иметь любой вид шкалы (количественные, порядковые, дихотомические).Группе наиболее больных пациенток присвоена кодировка 1, а условноздоровым — 0.Вероятность наступления события для некоторого случая рассчитывается поформуле 6:,(6)где z= b1*X1 + b2хХ2+ ...+ bnxXn+ a ,X1 — значения независимых переменных;b1 — коэффициенты, расчёт которых является задачей бинарнойлогистической регрессии;а — некая константа.В полученной в результате построения уравнения бинарной логистическойрегрессии классификационной таблице наблюдаемые показатели принадлежностик группе (1 = болен, 0 = здоров) противопоставляются предсказанным (р) наоснове рассчитанной модели. Принимается принадлежность к группе снегативнымпрогнозом(низкийрискпрогрессированияпатологическогопроцесса) — при р<0,5, принадлежность к группе с положительным прогнозом(высокий риск прогрессирования патологического процесса) — при р>0,5.72ГЛАВА 3РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1.