Автореферат (Морфологический анализ сперматогенеза - основа диагностики мужского идиопатического бесплодия (иммуногистохимический аспект)), страница 3

И.М.Сеченова, а также соответствуют Хельсинкской декларации (WMA Declaration ofHelsinki – ethical principles for Medical research involving Human subjects, 64th WMAGeneral Assembly, Fortaleza, Brazil, October, 2013).Методы исследования мужчин (n=30), страдающих бесплодием включаликлинико-морфологическое и генетическое обследование с первичным бесплодием:физикальныйосмотр,сборanamnesismorbietvitae,инструментальные(ультразвуковое исследование) и лабораторные данные (гормоны: ФСГ, ЛГ,тестостерон; спермограмма с MAR-тестом), цитогенетическая и молекулярногенетическая диагностика, а также биопсия яичка (оценка проводилась по шкале S.Johnsen, от 0 до 10 – нормальный сперматогенез).

Таким образом, быласформирована группа мужчин, учитывая следующие критерии: необструктивнаяазооспермия (по данным спермограммы) и ФСГ ≥11 мЕд/мл.Полученные аутопсийный (мужчины 22 – 35 и 64 – 75 лет) и биопсийныйматериал (мужчины 22 – 35 лет с идиопатическим бесплодием) фиксировали в 10%нейтральном формалине с фосфатным буфером, обрабатывали в аппаратегистологической проводки тканей фирмы «Pool scientific instruments» (Швейцария)и заливался в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материалане превышало 48 часов. Затем с каждого блока готовилось 25 ступенчатыхпарафиновых срезов толщиной 4–5 мкм, которые фиксировали на предметныеполилизиновые стекла (Mаinzel glаser, polylisine, Германия) и инкубировали втермостатепритемпературе37°Св13течение12часов.Далеесрезыдепарафинировалиирегидратировалипоследовательнов ряде растворов,состоящем из 3-х ксилолов, 2-х абсолютных спиртов, 2-х 95% спиртов, 80% и 70%спирта и дистилированной воды.

По одону препарату от каждого случаяокрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, поМассону, по Вайгерту, ШИК-реакция (прилож. I). В группе с нормальнымсперматогенезом (IА) для верификации мужских половых клеток (идентификациистадий мейоза) и клеток Сертоли в извитых семенных канальцах использовалиметод цитологических отпечатков (прилож. I). Морфометрическое исследованиеаутопсийногоибиопсийногоматериаловвыполнялинасветооптическоммикроскопе «Carl Zeiss Lab.A1» (Carl Zeiss, Германия), совмещённом свидеокамерой «AxioCam ERc5s» (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) ипрограммным обеспечением ZEN Lite.Иммуногистохимические реакции проводили по стандартной методике стермической демаскировкой антигенов.

Используемые первичные антитела, ихразведение и фирма производитель представлены в табл. 1. Вторичные антитела –универсальные (HiDef Detectionтм HRP Polymer system, «Cell Marque», США),позволяющиевыявлятьмышиныеикроличьипервичныеантитела,конъюгированные с ферментным комплексом на основе пероксидазы хрена.Результаты иммуногистохимических реакций оценивали количественными иполуколичественными методами.Таблица 1. Иммуногистохимическая реакция (используемые антитела).АнтителаIg класс, фирмаСпецифичность и характеристикаБЕЛКИ – МАРКЕРЫ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА КЛЕТКИMouse MonoclonalClone MM1 IgG1 Ядерный антиген; выявляется во всех пролиферирующих клеткахAntibodyв G1 (поздней), S, M и G2 фазах клеточного циклаNovocastraTMKi-67 Antigen1:100Mouse MonoclonalClone DO-7Ядерный антиген; определяется при остановке клеточного циклаAntibodyIgG2bпосле повреждения генома в точке G1 – клетка восстанавливаетр53 Proteinцелостность повреждённой ДНК до деления клетки или р53NovocastraTM1:100запускает в клетке механизм апоптоза.Mouse MonoclonalCloneЦитоплазматический антиген; белок внутреннейAntibodybcl-2/100/D5митохондриальной мембраны, который действует в качествеBcl-2 OncoproteinIgG1ингибитора апоптоза.NovocastraTM1:100Rabbit polyclonalIgGЦитоплазматический антиген внутреннего пути апоптоза;Antibodyактивирует гибель ядра и протеолитические процессы в клетке.Abcam1:100caspasa-9ФАКТОРЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МУЖСКИХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОКPrimary AntibodyClone 8A9Цитолеммальный антиген; в норме – визуализируется в мембранеIgG1синцитиотрофобласта ворсин хориона и плаценты и вPlacental alkaline14Mouse MonoclonalAntibody c-kitOncoprotein(CD117)BondTM1:100Clone T595IgG1NovocastraTM1:100Rabbit polyclonalAntibodyInsulin-like GrowthFactors-IIgG1Santa CruzBiotechnology1:100phosphatase (PLAP)гонобластах/гоноцитах.Цитоплазматический стволовой антиген; в норме –обнаруживается в гонобластах/гоноцитах, а также в глиоцитах,тучных клетках, меланоцитах и эпителии молочной железы.Слабое окрашивание также выявили в собирательных трубочкахпочек, иногда в эпителии предстательной железы и в коллоидещитовидной и паращитовидных желез.ФАКТОР РОСТАЦитоплазматический антиген;показатель пролиферативной митотической активности клеток;аутокринный/паракринный стимулятор роста.Учитывая специфику исследуемого объекта (яички), где половые клетки присветовоймикроскопиираспределения«перекрывают»внутриклеточныхдругбелковдруга,апроводилитакжеособенностьподсчётчислаиммунопозитивных клеток (в 100 клетках в 10 полях зрения светового микроскопапри увеличении объектива ×40, в%) и оценивали степень экспрессии (ve +/–) (прил.II).Метод иммуногистохимического анализа предварительно апробировали на образцах семенникови некоторых других органов (лёгкие, головной мозг, сердце) белых беспородных крыс-самцов(кафедра гистологии и эмбриологии педиатрического факультета РГМУ им.

Н.И. Пирогова,заведующая – академик РАН, д.м.н., профессор О.В. Волкова) (прил. I).Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ).Фрагменты биоптатов яичек были помещены в стабилизирующий растворRNAlater (QIAGEN, Нидерланды) и хранились при –70°C. Впоследствии образцыподверглигомогенизациисогласностандартномупротоколу.Экстракциютотальной РНК производили с использованием набора готовых реактивов RNeasyPlus Mini Kit (QIAGEN, Нидерланды).

Синтез комплементарной ДНК (кДНК) сматрицы полученной РНК осуществляли с помощью набора SuperScript™ VILO™MasterMix(Invitrogen).Выделенныек-ДНКподверглисьПЦР-РВсиспользованием готовой смеси реагентов ABsolute Blue QPCR Mix (ThermoScientific, США) с интеркалирующим флуоресцентным красителем SYBR Green I.ПЦР-РВ проводилась с использованием StepOne System (Applied Biosystems, CША)и штатного программного обеспечения. Анализ экспрессии генов проведен сиспользованием метода определения порогового цикла (Ct) и вычисленияотносительной экспрессии генов согласно протоколу (Schmittgen T., Livak K.15Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method, 2008).

Нормирование ивнутренний контроль выполнены относительно референсного гена GAPDH.Статистический контроль проводился относительно I.А. группы с нормальнымсперматогенезом (аналогичного возраста с бесплодными мужчинами). Подборпраймеров был осуществлён на основании общедоступных материалов опоследовательностях ДНК и м-РНК генов в базе данных NCBI с использованиемпрограммы Primer-BLAST (табл.

2).ГенBAKBAXBCL2BCLWGAPDHТаблица 2. Используемые праймеры.5´-праймер3´-праймерCACGGCAGAGAATGCCTATGACCCAATTGATGCCACTCTCAAGTCGCCCTTTTCTACTTTGCCAG TCCAGCCCAACAGCCGCTCCTCCGATCAGGAAGGCTAGAGTT TCGGTCTCCTAAAAGCAGGCTCCAGCCCAACAGCCGCTCCCAGTGGTTCCATCTCCTTGTTGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAGAAGATGGTGATGGGATTTCСтатистические методы и обработка данных. Полученные в результате подсчётаданные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 7.5 forWindows statistical software package (IBM Analytics, США). При этом определяливариационные ряды, среднюю арифметическую, среднеквадратическое отклонения,среднюю ошибку и вероятность различия.

Затем оценивали соответствие/несоответствиеполученныхрезультатовнормальномураспределениюсприменением критерия Колмагорова–Смирнова. При статистической обработке дляоценки достоверности различий средних значений между группами использовалисьследующие непараметрические критерии: U-критерий Манна–Уитни, Н-критерийКраскалла-Уоллеса.Приотсутствиинормальногораспределенияданныхиспользовали непараметрический критерий F. Wilcoxon (Statistical methods forresearch workers) с уровнем значимости p<0.05.

Количественные данные,полученные в ходе ПЦР-РВ, были проанализированы с использованием ранговогодисперсионного анализа ANOVA.Результаты исследования и их обсуждениеМикроскопическое описание яичек мужчин IА и IБ группы. Стенки семенныхканальцев образованы клетками Сертоли и половыми клетками, находящимися наразличных стадиях сперматогенеза. Во всех исследуемых образцах в каждойподгруппевыявляютсяморфологические16признакифизиологическогосперматогенеза (8 – 10 баллов по шкале S. Johnsen).

Сперматогонии лежат ближе кбазальной мембране, занимая базальные отсеки семенных канальцев, клеткисперматогенного эпителия на последующих стадиях сперматогенеза локализуютсяв адлюминальном отсеке, а сперматозоиды – в просветах канальцев. Вбольшинстве семенных канальцев гаметы образуют отдельную функциональную«колонку», в которой все они находятся на одной из шести стадий цикласперматогенеза. Сперматогонии, которые не вступили в мейоз, несут функциюсперматогониальных стволовых клеток (SSC), пополняющие сперматогониальныйпул. В семенниках лиц пожилого возраста визуализируются дистрофическиеизменениясперматогенногоэпителия,местамиотмечаетсяуплотнениеволокнистого компонента перитубулярных пространств и стенок кровеносныхсосудов.