Автореферат (Морфологический анализ сперматогенеза - основа диагностики мужского идиопатического бесплодия (иммуногистохимический аспект))

На правах рукописиДЕМЯШКИНГРИГОРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СПЕРМАТОГЕНЕЗА –ОСНОВА ДИАГНОСТИКИ МУЖСКОГОИДИОПАТИЧЕСКОГО БЕСПЛОДИЯ(ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АСПЕКТ)14.03.02. – Патологическая анатомияА В Т О Р Е Ф Е Р А Тна соискание учёной степени кандидата медицинских наукг. Москва2017 г.1Работа выполнена в ФГАОУ ВО Первый Московский Государственныймедицинский университет им. И.М.

Сеченова (Сеченовский Университет)Минздрава РоссииНаучный руководитель:доктор медицинских наук, профессор Коган Евгения Алтаровназаведующая кафедрой патологической анатомией имени академика А.И. СтруковаОфициальные оппоненты:Астраханцев Александр Федорович, доктор медицинских наук, профессор,НУЗ «Центральная клиническая больница №2 им. Н.А.Семашко ОАО «РЖД»,заведующий патологоанатомическим отделением;Михалева Людмила Михайловна, доктор медицинских наук, профессор,городская больница №31 Департамента здравоохранения г. Москвы, заведующаяпатологоанатомическим отделением.Ведущаяорганизация:ФГБНУ«Научно-исследовательскийинститутморфологии человека».Защита диссертации состоится «___» « ___________» 2017 г.

в _____ часов назаседании диссертационного совета Д. 208.040.01 при ФГАОУ ВО Первый МГМУим. И.М.Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) по адресу:119991 Москва, Трубецкая ул., д.8, стр. 2С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинскойбиблиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу:119034, Москва, Зубовский бульвар, д.37/1 и на сайте www.sechenov.ruАвтореферат диссертации разослан «____» «________________» 2017 г.Ученый секретарь диссертационного советадоктор медицинских наук,профессор2Борис Борисович СалтыковОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемыС каждым годом прослеживается неуклонный рост частоты мужского бесплодиякак в России, так и в других странах Мира. При этом обеспечивается низкаяэффективность распознавания причин идиопатических форм.

Объяснением ростабесплодияслужат:прогрессивноеухудшениеэкологическойобстановки,оказывающей существенное влияние на репродуктивное здоровье населения,повторяющиеся экономические кризисы и потрясения, негативно влияющие напсихику человека, массовое употребление некачественных продуктов и лекарств,содержащих малополезные и даже вредные ингредиенты, неблагоприятнаярадиационная обстановка на Планете из-за аварийна Чернобыльской иФукусимской атомных станциях, сомнительное качество морепродуктов из-занарушения экологии моря, ухудшение состояния атмосферы по причине вредныхвыбросов и др.

Перечисленные факторы негативно влияют на мужскуюрепродуктивную систему. О состоянии репродуктивного здоровья мужской частинаселения свидетельствуют данные ряда исследований. Около 30% всех случаевмужского бесплодия составляют идиопатические формы, причины которых невыяснены и не понятны (Брагина Е.Е. и др, 2002; ВОЗ, 2000).По мнениюРайциной С.С. (1969), Кагана С.А. (1985), А.И. Лысенко (2008), Астраханцева А.Ф.(2011), Курило Л.Ф. и др. (2000), совокупность нейро-эндокринных и локальныхмеханизмов составляет репродуктивную стратегию защиты генома развивающихсяполовых клеток и до 20% случаев нарушений мужской репродуктивной системысвязаны с количественными или структурными аномалиями хромосом. Нет такжеединогласия в отношении этиологии, патогенеза, диагностики и лечения мужскогобесплодия.Как известно, в физиологии половых желез (не только мужских, но и женских)существует тесная связь между генеративной (гаметы) и эндокринной функциями –если страдает одна из них, вторая, как правило, не бывает полноценной.Результаты исследований последнего десятилетия (Волковой О.В., Боровой Т.Г.,Коган Е.А.

и др.) значительно расширили рамки понимания эндокриннойактивности половых желез: сегодня эта функция представляется более широко и3включает не только образование и секрецию половых стероидных гормонов, но ивыработку множества других биологически активных соединений, источникамикоторых в половых железах являются клетки-эндокриноциты, сами половыеклетки, клетки Сертоли и даже клетки стромы, не принадлежащие к категорииэндокринных.Кроме того, мало изучена роль метаболитов распадающихся клеток, которыевозможно также выступают как аутокринные и паракринные регуляторы (ЯрыгинК.Н., Холоденко И.В., Скворцова В.И.

и др., 2009).Яички являются уникальным органом. В них заключено колоссальное количествоструктур, занимающих при этом мизерный объем – множество извитых семенныхканальцев (длина одного семенного канальца составляет 80 см, а общая – 300 – 400м). Несмотря на малые размеры органа, яички несут огромную функциональнуюнагрузку, производя секрецию сперматозоидов, количеством до 200 миллионов в 1мл, размеры которых в пределах 5 мкм. При этом, жизненно важные процессы воргане проходят при относительно небольшом количестве соединительной ткани иклеток мононуклеарной системы, тем самым ограничивая его защитные функции.Яички располагаются по периферии организма, как бы «автономно». Подобное«отдаленное» расположение яичек не способствует защите от химических,биологических и физических (механических, температурных), в том числерадиационных воздействий (Bostwick D.G., 2014; В.Н.

Ярыгин, Г.Г. Кругликов,1990). Возможно, поэтому в них сформированы плотные волокнистые оболочки имногоструктурные гемато-тестикулярные барьеры. Учитывая вышеперечисленныеорганоспецифические особенности, остаётся весьма затруднительной диагностикаи прогноз, как воспалительных изменений, так и нарушений сперматогенеза(бесплодие).Сперматогенез протекает под контролем специфических генов развивающихсягамет и регулируется совокупностью гормонов, цитокинов, факторов роста,синтезируемых как в органах самой половой системы, так и вне ее.Несмотря на совершенствование методов диагностики с каждым годом вразвитых странах прослеживается неуклонный рост мужского бесплодия в видеазооспермии(секреторнаяформапреобладает4надобструктивной).Приазооспермии диагностически наиболее точным является гистологический анализбиопсийного материала тканей яичка, выявляющий степень поражения половыхклеток, а также возможный риск малигнизации.

Используемые на практикекритерии оценки степени поражения половых клеток были разработаны ещё в 70-хгодах прошлого века (критерий Johnson, De Kretser, Holstein), поэтому нуждаются вмодернизации с учётом современных методов гистологического исследования.Без глубокого познания факторов, воздействующих на семенник и оказывающихположительное либо отрицательное влияние на его герминативную и эндокриннуюфункции, невозможно решать вопросы мужского бесплодия, в том числе,–идиопатических форм, и, соответственно, вести поискпутейлечения вправильном направлении.

Широкая перспектива в исследовании морфофизиологииполовыхжелезоткрыласьсвнедрениемметодовиммуноцито-ииммуногистохимии, которые позволили адресно исследовать in situ процессысинтеза разных биологически активных модуляторов гаметогенеза. Имеющиеся вмировой литературе результаты исследований указывают на важнейшее значениепара- и аутокринных факторов яичек и яичников в реализации мужского иженского гаметогенеза. Однако в проблеме идиопатических форм мужскогобесплодия возможности этого метода до конца не реализованы, крайненедостаточно работ в этом направлении проводится как в России, так и за рубежом.Комплексное изучение особенностей физиологического состояния мужскихполовых клеток, эндокриноцитов и клеток стромы яичек при данной патологии,несомненно,способствовалобыпрогрессу знанийвобластипатогенезаидиопатических форм мужского бесплодия.

Иммуногистохимический анализ,охватывающий как общий, так и специфический аспекты метаболизма клеточныхкомпонентов семенных канальцев и интерстициальной ткани семенников,несомненно, окажет действенную помощь в этом направлении.Степень разработанности темыСреди авторов общими вопросами патоморфологии сперматогенеза при бесплодиизанимались:Е.Н.Бочарова(ГБУЗ«Московскийнаучно-практическийЦентрдерматовенерологии и косметологии ДЗМ»), А.И. Щеголев (ФГБУ НЦ Акушерства,гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова, г.

Москва, Россия).5Однако, по многим направлениям проблемы мужского бесплодия еще существуетвесомый дефицит информации.Большинство исследований выполняются на экспериментальных животных и полностьюэкстраполировать их результаты на человека не правомерно. Что касается идиопатическойформы бесплодия у мужчин, то их экспериментальное моделирование не представляетсявозможным, – и в этих случаях долженанализироваться исключительно клиническийматериал.Целью исследования является выявление патоморфологических и молекулярныхмеханизмов нарушения сперматогенеза при идиопатическом бесплодии.Задачи исследования:а)Оценитьактивностьиммуногистохимическогомаркированиямужскихполовых клеток и соматических клеток яичек на факторы пролиферации и апоптоза(Ki-67, Bcl-2, p53, каспазы-9), факторы дифференцировки (PLAP, CD117) приидиопатическом бесплодии (при необструктивной азооспермии).б) Провести сравнительный иммуногистохимический анализ перечисленныхвыше факторов в структурах яичек лиц молодого и пожилого возрастов, отметивсходство и/или отличия от аналогичных показателей при идиопатическомбесплодии.в) Выявить степень активности инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-I) вмужских половых клетках, клетках Сертоли и клетках Лейдига в норме и приидиопатическомформемужскогобесплодиясиспользованиемиммуногистохимического метода.г) Определить степень экспрессии генов-регуляторов клеточного цикла мужскихгамет при идиопатическом бесплодии (проапоптотические BAK и BAX иантиапоптотические BCL2 и BCLW).д)Разработатьалгоритмклинико-морфологическогоисследованиядлядиагностики идиопатическом бесплодия.Основные положения, выносимые на защиту:1.Идиопатическая форма мужского бесплодия характеризуется снижениемуровня пролиферации сперматогоний на ранних стадиях (гипосперматогенез, блоксозревания) по сравнению с нормальными показателями и полным отсутствиемпролиферации сперматогоний на более поздних стадиях развития этой патологии6(фокальный вариант Сертоли-клеточного синдрома).

При этом в семенныхканальцах наблюдается гипосперматогенез с резким снижением численностисперматогоний и их отсутствие при блоке созревания. В сперматогониях, вкоторыхопределяетсяPLAP-позитивнаяреакция,расцениваютсякакэмбриональные, а отсутствие мечения на фактор дифференцировки CD117указывает на бесперспективность дальнейшего развития этих клеток.2.Патогенезблокасозреваниямужскихполовыхклетокпригипосперматогенезе связан со снижением содержания IGF-I в сперматогониях.3. Физиологический сперматогенез характеризуется доминированием процессапролиферациисперматогонийнадихапоптозом.Даннаязакономерностьприсутствует и в популяции первичных сперматоцитов у мужчин пожилоговозраста, что отличает механизм старение от патогенеза идиопатическогобесплодия.4.Клинико-морфологическая диагностика идиопатической формы мужскогобесплодия должна включать в себя комплекс морфологических и молекулярныхметодовисследования:биопсияяичек,иммуноцитохимический,иммуногистохимический (Ki-67, Bcl-2, p53, каспазы-9, PLAP, CD117, IGF-I), ПЦРРВ (на гены BAK, BAX, BCL2, BCLW).Научная новизнаВыявленымолекулярно-биологическиеособенностипролиферации,дифференцировки и апоптоза мужских гамет (прежде всего сперматогоний) припатологическом сперматогенезе в сравнении с нормальным гаметогенезом вмолодом и пожилом возрастах:Впервые доказано, что в сперматогониях при мужском идиопатическомбесплодии на фоне низкой степени пролиферации (Ki-67 – 12.0±0.34%, р<0.05)отмечается увеличение показателей готовности к апоптозу (Bcl-2 – 1.0±0.1%; р53 –40,0±0.44%; р<0.05) в то время, когда закономерность течения нормальногосперматогенеза демонстрирует значительное преобладание процесса пролиферациинад апоптозом у молодых мужчин по данным иммуногистохимического анализа иПЦР-РВ.7Впервыеустановлено,иммунофенотипированиячтоклетоквнанормесоотношениефакторыпролиферацииактивностииапоптозасперматогенеза меняется в зависимости от возраста: у молодых лиц показателипролиферации (Ki-67 – 42.0±0.34%, р<0.05) и апоптоза (caspasa-9 – 39.5±0.33%,р<0.05) выше чем у пожилых (Ki-67 – 34.1±0.6%, р<0.05; caspasa-9 – 35.6±0.4%,р<0.05).