Автореферат (Морфологический анализ сперматогенеза - основа диагностики мужского идиопатического бесплодия (иммуногистохимический аспект)), страница 4

Появление ангиотрофических нарушений вызывает снижение транспортабиологически активных веществ через гемато-тестикулярный барьер, приводя квыраженным дегенеративным процессам в половых клетках. Кроме того, свозрастом уменьшается количество клеток Лейдига (прил.

III).Микроскопическое описание яичек мужчин II группы, с идиопатической формойбесплодия (n=30). В биоптатах яичек у разных пациентов наблюдали различнуюморфологическую картину: у 3-х – гипосперматогенез (в семенных канальцахрасполагаются сперматогонии и разрушенные первичные сперматоциты); у 21-го –блоксозреваниясфокусамисубтотальнойаплазиигамет(единичныесперматогонии); у 5-ти – Сертоли-клеточный синдром (только клетки Сертоли); у1-го –тубулярная атрофия канальцев. Также, во всех исследуемых случаяхвыявили гиперплазию клеток Лейдига (прил.

II). Выявленные морфологическиеразличияподтверждаютналичиенесколькихгистологическихвариантовизменения извитых семенных канальцев при идиопатической форме мужскогобесплодия.Данные иммуногистохимического исследования яичек I и II групп (табл. 3) (прил.III) (уровень значимости p<0.05).Анализ маркеров клеточного цикла. Белок Ki-67 был обнаружен во всех половыхклетках, как в нормальном, так и патологическом сперматогенезе. Клетки Сертолии Лейдига, миоидные клетки были иммунонегативными. Индекс пролиферации17(Ki-67) сперматогоний мужчин 22 – 35 лет контрольной группы составляет42.0±0.34%, что в 3,5 раза выше чем при идиопатическом бесплодии (12.0±0.1%).Проапоптотический индекс (p53) сперматогоний в контрольной I.A.

(57.2±0.66%; упожилых – 12.2±0.3%) группе выше чему у сперматоцитов I в 2,0 раза (28.5±0.5%)и в 3,9 раза у сперматоцитов II (14.5±0.33%). Количество окрашенных на р53сперматогоний при необструктивной азооспермии в 2,6 раза выше, чем в контролеу мужчин 22 – 35 лет. Уровень экспрессии каспазы-9, активация которойпроисходит при реализации митохондриального пути апоптоза, в сперматогониях снормальным сперматогенезом находится примерно на одном уровне (процентмеченых сперматогоний составляет у молодых мужчин – 39.5±0.33%, у пожилых –35.6±0.44%) и снижен при идиопатической форме мужского бесплодия на стадиигипосперматогенеза (22.0±0.22%). При дальнейшем развитии патологическихизменений этот показатель возрастает и при фокальном варианте Сертоликлеточного синдрома составляет уже 72.0±0.41%.

Ни в одном из гистотиповидиопатического бесплодия в клетках Лейдига и в миоидных клетках каспазы-9 невыявлено (ve–). Анализ маркирования на Bcl-2 показывает, что антиапоптотическаяактивность превалирует в половых клетках у мужчин 22 – 35 лет (43.2±0.44%),снижается в пожилом возрасте (14.1±0.2%) и практически исчезает на всех стадияхнарушенного сперматогенеза (1.0±0.1%). Доля ИГХ-позитивных половых клеток наBcl-2 в пожилом возрасте составило: сперматогонии – 11.3±0.1%, сперматоциты I –53.2±0.3%, сперматоциты II – 27.4±0.2%, сперматиды – 9.1±0.3%.

Таким образом, внорме наибольшей антиапоптотической активностью обладают сперматоцитыпервого порядка (у молодых – 46.0±0.55%) – клетки, вступившие в редукционноеделение мейоза. Учитывая данные пролиферации и апоптоза, а также про- иантиапоптотической активности сперматогоний при бесплодии можно говорить одисбалансе – преобладание апоптоза над пролиферацией. При этом причинаинициированияаутокриннымиапоптозавнарушениямисперматогонияхлибовероятнееповреждениямивсегомитохондрий,связанаастакжеувеличением уровней окислительного стресса.Анализ факторов дифференцировки половых клеток.

У мужчин пожилоговозраста на фоне отсутствия положительной реакции на CD117 в сперматогониях18(ve–) и первичных сперматоцитах обнаружено иммуномечение в гаметах, начинаясо второго (эквационного) мейотического деления (на стадии вторичногосперматоцита) (ve+/3), что указывает на снижение уровней герминальнойдифференцировки, в отличие от зрелого возраста, где данный фактор выявляетсяуже на стадии митоза сперматогоний. Таким образом, в группе мужчин 64 – 75дифференцировка гамет преобладает над пролиферацией.

В связи с чем, у пожилыхлюдей возникает высокий риск передачи хронических заболеваний потомству придеторождении в этом возрасте. Исследуемый маркёр в сперматогониях приидиопатическом бесплодии не выявляется, то есть, сперматогониальные клетки(SSC) в семенных канальцах отсутствуют, равно как и нет клеток, обладающихунипотентными свойствами и обновляющихся популяций половых клеток. Один изфакторов эмбриональной дифференцировки мужских гамет (PLAP) у мужчинмолодого и пожилого возрастов в норме не обнаружен. В то время, как в10.2±0.13% сохранившихся сперматогоний при гипосперматогенезе отмечаетсяположительная цитолеммальная ИГХ-реакция с антителами к PLAP, что неисключает наличие в семенных канальцах единичных малодифференцированныхклеток. А также, учитывая, что PLAP является маркером тестикулярнойинтроэпителиальной неоплазии, нельзя исключить, что бесплодие попадает вгруппу риска по малигнизации.Анализ фактора роста (IGF-I).

В контрольной группе наиболее яркомаркируются половые и в меньшей степени соматические клетки семенныхканальцев и их микроокружения. Выраженность иммунологической реакции сантителами к IGF-I в мужских гаметах снижается в процессе сперматогенеза: отсперматогоний («ve+/3») до сперматозоидов («ve+/2»). Окрашивание на IGF-I как всоматических,такивполовыхклеткахподтверждаетфункциональнуюнеобходимость данного фактора роста в региональном механизме ауто- ипаракринной регуляции текущих процессов в яичке и семенных канальцах вчастности. Отсутствие специфического маркирования стромальных компонентовсвидетельствует о её вспомогательной роли в этих процессах. В то время, как приидиопатическомбесплодииотмечаетсяслабоеокрашиваниенаIGF-Iвсперматогониях и снижение его количества в 8,8 раза (7.0±0.22%) по сравнению с19таковой возрастной группой в контроле (62.0±0.33%) и на 5,7% у пожилых мужчин(40.0±0.33%). Более вероятно, что существует нарушение паракринной регуляциисинтеза инсулиноподобного фактора роста-1 при бесплодии.Таблица 3.

Доля ИГХ-позитивных сперматогоний в семенных канальцах на исследуемыемаркеры в нормальном сперматогенезе и при идиопатическом бесплодии (%)нормальныйсперматогенезидиопатическое бесплодиеАнтителаKi-67р53Bcl-2каспаза-922 – 35лет42.0±0.3457.2±0.667.5±0.4439.5±0.3361 – 74года34.1±0.6 ⃰12.2±0.3 ⃰11.3±0.1 ⃰35.6±0.44 ⃰гипосперматогенез15.0±0.1⃰ ⃰40.0±0.44⃰ ⃰1.0±0.1⃰ ⃰22.0±0.22блоксозревания12.0±0.1⃰ ⃰64.3±0.39⃰ ⃰064.3±0.39⃰ ⃰фокальныйвариант СКС9.0±0.2⃰ ⃰72.0±0.41⃰ ⃰072.0±0.41⃰ ⃰PLAPCD117IGF-I010.0±0.3339.5±0.3306.0±0.3 ⃰35.6±0.44 ⃰10.2±0.13% ⃰ ⃰07.0±0.1⃰ ⃰005.3±0.6⃰ ⃰001.0±0.2⃰ ⃰⃰– статистически достоверные различия (при p<0.05) между I.A. и I.Б.

контрольными подгруппами.⃰ ⃰ – статистически достоверные различия (при p<0.05) между контрольной группой I.A. и группой лиц,страдающих бесплодием.Анализ экспрессии генов посредством ПЦР-РВ. В ходе оценки уровня экспрессиигенов, продукты которых ответственны за внутриклеточную регуляцию апоптоза,были выявлены существенные статистические различия (p<0.05) как междуисследуемыми образцами биоптатов яичек группы II (идиопатическое бесплодие) cразнымипатоморфологическимиформами,обнаруженнымивходегистологического исследования, так и при их сравнении с контролем. Выявленозначительное повышение относительного уровня экспрессии проапоптическихгенов внутреннего пути BAX и BAK, наиболее выраженное в группе пациентов сгипосперматогенезом (рис.

1). Напротив, экспрессия антиапоптотических геновBCL2 и BCLW оказалась снижена. При этом обнаружено, что значенияотносительной экспрессии гена BCLW значительно ниже контрольного уровня вовсех патоморфологических формах пациентов с идиопатическим бесплодием, в товремя как уровень экспрессии BCL2 изменен умеренно (рис. 2).Заключение. При бесплодии изменение баланса генов в сторону увеличенияэкспрессии проапоптотических генов (BAK, BAX) и снижения антиапоптотическихгенов (BCL2, BCLW) способствует индукции апоптоза уже на ранних этапах.20BAXBAK2 .54**2 .03*1 .5**БМC КС21 .010 .50 .00КРГСБМКРC КСГСРисунок 1.

Экспрессия проапоптотических генов BAK и BAX в яичках пациентов с нормальнымсперматогенезом (группа IА) и при идиопатическом бесплодии (группа II). По вертикали:относительный уровень экспрессии, усл. ед.; КР – контроль (I группа, 22 – 35 лет); ГС – гипосперматогенез;БМ – блок мейоза; СКС – Сертоли-клеточный синдром. *– статистически значимые отличия от контроля,p < 0.05.BCLWBCL22 .51 .02 .00 .8**0 .61 .50 .41 .00 .20 .50 .00 .0КРГСБМ*ГСБМ*КРC КС*C КСРисунок 2. Экспрессия антиапоптотических генов BCL2 и BCLW в яичках пациентов с нормальнымсперматогенезом (группа I) и при идиопатическом бесплодии (группа IV). По вертикали: относительныйуровень экспрессии, усл.

ед.; КР – контроль (I группа, 22 – 35 лет); ГС – гипосперматогенез; БМ – блокмейоза; СКС – Сертоли-клеточный синдром. *– статистически значимые отличия от контроля, p < 0.05.Резюме. Таким образом, сперматогенез – сложнейший, богатый событиямибиологический процесс, важнейшая роль в регуляции которого, наряду сцентральнымиигуморальнымимеханизмами,принадлежитрегиональныммеханизмам (интратестикулярным).При мужском идиопатическом бесплодии в регуляции сперматогенеза важнаяроль принадлежит соматическим и эндокринным клеткам. Очевидно, чтостимуляция паракринной регуляции сперматогенеза способствует реализациисобственных сепаративных механизмов.