Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (Л. Страйер - Биохимия в 3-х томах), страница 3

24.12. Модель двухспиральной молекулы ДНК. Показаны три парыоснований. Обратите внимание, что две цепи ориентированы в противоположном направлении.тельно, одно из оснований в паре в двойной спирали ДНК всегда должно быть пурином, а другое - пиримидином. Крометого, на спаривание оснований накладывают ограничения правила образованияводородных связей. Атомы водорода в пуриновых и пиримидиновых основаниях занимают вполне определенные положения.Аденин не может спариваться с цитозином,так как тогда на месте одной связи оказалось бы два атома водорода, а на местедругой - ни одного.

Точно так же гуанин неможет связываться с тимином. Аденин, наоборот, образует с тимином две водородные связи, а гуанин - три водородныесвязи с цитозином (рис. 24.9 и 24.10).Ориентация этих водородных связей и расстояние между ними оптимальны длясильного взаимодействия между основаниями.Эта схема спаривания оснований получила убедительное подтверждение в резуль14Часть IV.Информациятате проведенных ранее исследований нуклеотидного состава ДНК разных видов.В 1950 гг. Эрвин Чаргафф (Erwin Chargaff)обнаружил, что соотношение аденина с тимином и гуанина с цитозином у всех исследованных видов было близко к 1. Значениеэтого факта оставалось неясным, пока небыла предложена модель Уотсона-Крика(рис.

24.12 и 24.13). Только тогда стало понятным, что эта закономерность отражаетважнейшее свойство структуры и функцииДНК - специфичность спаривания оснований.24.5. Комплементарные цепи служатматрицами друг для д р у г апри репликации ДНКМодель двухспиральной молекулы ДНКпозволила сразу же предложить механизмрепликации ДНК. Уотсон и Крик опубликовали свою гипотезу через месяц послетого, как представили модель структурыДНК в виде прекрасной статьи, отличавшейся простотой и ясностью.«Если задан определенный порядок оснований в одной из цепей, можно написать точную последовательность оснований в другой цепи, поскольку спариваниеспецифично.

Таким образом, каждая изцепейкомплементарнадругойцепи,и именно это свойство подсказывает, каким образом может удваиваться молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты.Прежние дискуссии о самоудвоениивсегда опирались на представление о некой матрице или каком-то шаблоне.Предполагалось, что матрица копируетнепосредственно самое себя, или должнаобразовывать «негатив», который в своюочередь действует в качестве матрицыи образует исходный «позитив». Нив одном случае не было предложено детального объяснения, как это могло быпроисходить на уровне атомов и молекул.В нашей модели дезоксирибонуклеиновой кислоты имеется, по существу, параматриц, причем каждая из них комплементарна другой.

Мы полагаем, чтоперед удвоением водородные связи разрываются и две цепи раскручиваютсяи расходятся. Затем каждая цепь используется в качестве матрицы для образования на ней новой комплементарной цепи,так что в конце концов у нас будет двепары цепей, тогда как раньше былатолько одна. Более того, при таком способе репликация последовательность пароснований будет в точности удвоена».24.6. Репликация ДНК полуконсервативнаУотсон и Крик предположили, что одна изцепей каждой дочерней молекулы ДНКсинтезируется заново, а другая происходитот родительской молекулы ДНК. Такоераспределение атомов родительской молекулыназываютполуконсервативным.Метью Меселсон и Франклин Сталь(Matthew Meselson, Franklin Stahl) поставили принципиально важный экспериментдля проверки этой гипотезы.

Родительскую ДНК пометили тяжелым изотопом15азота N, чтобы сделать ее более тяжелой, чем обычная ДНК. Для этого выращивали Е. coli в течение многих поколенийв среде, содержавшей в качестве единственного источника азота 15NH4Cl. Затем бактерии быстро переносили в среду, содержавшую 14 N-стабильный изотоп азота.Этот эксперимент должен был показать,как распределяются изотопы 14N и I 5 Nв молекулах ДНК в ходе последующихциклов репликации.Распределение 14N и 15 N в потомствеизучали с помощью только что разработанного метода равновесной седиментациив градиенте плотности.

Небольшое количество ДНК растворяют в концентрированном растворе хлористого цезия с плот-Рис. 24.13.Пространственнаямодельдвойной спирали ДНК. Отчетливо видны большая бороздка(показана красным цветом)и малая бороздка (показана синим цветом).

Обратите внимание, что часть каждого основания доступна для взаимодействия с другими молекулами.(Печатается с любезного разрешения д-ра Sung-Hou Kim.)ностью, близкой к плотности ДНК( ~ 1 , 7 г/см3). Этот раствор центрифугируют почти до равновесного состояния.Под действием противодействующих процессов седиментации и диффузии в центрифужной ячейке возникает градиент концентрации хлористого цезия. В результатесоздается устойчивый градиент плотностиот 1,66 до 1,76 г/см3. Под действием центробежной силы молекулы ДНК переходятв ту область градиента, в которой плотность раствора равна их собственной плавучей плотности. Высокомолекулярная24. ДНК: генетическая роль,структура и репликация15Рис. 24.14.Разделение 14N- и 15N-ДНКпри центрифугировании в градиенте плотности.

А - фотография центрифужной ячейкив ультрафиолетовом свете;Б - денситометрическая криваяпоглощения, полученная присканированиифотографии,приведенной на рис. А.[Meselson M., Stahl F. W., Proc.Nat. Acad. Sci., 44, 671 (1958).]ДНК образует четко выраженную полосу,обнаруживаемую по поглощению ультрафиолетового света. Молекулы 14N-ДНК и15N-ДНК хорошо разделяются в такомградиенте, поскольку их плотность различается примерно на 1% (рис.

24.14).ДНК выделяли из бактерий через различные промежутки времени после переноса со среды, содержащей 15N, на 14N. Анализ этих образцов центрифугированиемв градиенте плотности показал, что послеодного цикла репликации ДНК дает однуполосу (рис. 24.15). Плотность этой полосыбыла равна в точности среднеарифметическому значению между плотностью 14N- и15N-ДНК.

Отсутствие 15N-ДНК свидетельствовало о том, что целостность родительской ДНК в ходе репликации нарушается. Отсутствие 14N-ДНК показывало,что часть атомов всех дочерних молекулДНК происходила от родительской ДНК.Соотношение 14N и 15 N в дочерних молекулах должно составлять 1:1, так как плотность гибридных молекул ДНК была средней между 14N- и 15N-ДНК.После двух циклов репликации ДНКраспределялась поровну в двух полосах.Однаизних - гибриднаяДНК,другая - 14N-ДНК. Меселсон и Стальсделали из этих убедительных эксперимен16Часть IV.Информациятов вывод, «что азот молекул ДНК распределяется поровну между двумя физически раздельными структурами, что послеудвоения каждая дочерняя молекула получает одну из этих структур и что этиструктурысохраняютсяинтактнымив течение многих удвоений».

Полученныерезультатыпрекрасносогласовывалисьс моделью репликации ДНК Уотсона—Крика (рис. 24.16).24.7. Некоторые вирусы содержатна определенных стадиях жизненного циклаодноцепочечную ДНКДНК не всегда двухцепочечная молекула.Роберт Синсхеймер (Robert Sinsheimer) обнаружил, что ДНК фага φ Х 1 7 4 , небольшого вируса, заражающего Е. coli,- одноцепочечная молекула. Несколько экспериментальных фактов привели его к этомунеожиданному выводу. Во-первых, соотношение оснований в ДНК фага φХ174 неудовлетворяет правилу [А] = [Т] и [G] == [С]. Во-вторых, вязкость раствора ДНКфага φХ174 значительно меньше вязкостираствора ДНК Е.

coli той же концентрации. Гидродинамические свойства ДНКфага φХ174 соответствуют полимерув конформации случайного клубка. В отличие от этого ДНК в форме двойной спирали ведет себя гидродинамически как оченьжесткая палочка. В-третьих, аминогруппыоснований ДНК фага φХ174 легко реагируют с формальдегидом, тогда как основания в двойной спирали ДНК почти недоступны для этого реактива.Обнаружение этой одноцепочечной ДНКпородило сомнения в универсальностисхемы полуконсервативной репликации,предложенной Уотсоном и Криком. Однако вскоре было показано, что ДНК фагаφХ174 находится в одноцепочечном состоянии только на протяжении части жизненного цикла вируса.

Синсхеймер обнаружил, что зараженные клетки Е. coli содержат двухцепочечную форму ДНК фагаРис. 24.15.Доказательство полуконсервативной репликации в клетках Е.coli с помощью центрифугирования в градиенте плотности.Положение полосы ДНК зависит от содержания 14N и 15N.После 1,0 генерации все молекулы ДНК представляют собой гибриды, содержащие равное количество 14N и l 5 N.Родительская ДНК ( 1 5 N) после1,0 генерации не обнаруживается. [Meselson M., Stahl F.W.,Proc. Nat.