Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, страница 8

На сегодняшнийдень существует целый ряд работ, демонстрирующих повышение титра антител всыворотке крови или цереброспинальной жидкости у пациентов с РС к даннымаутоантигенам. Самым распространенным белковым компонентом миелина (около 50%всех белков) является протеолипидный белок (PLP) с молекулярной массой порядка 30кДа. Вторыми в количественном соотношении (около 30%) являются три изоформыосновного белка миелина.

Известно, что ген MBP человека расположен на 18 хромосоме иимеет 3 промоторные области. В процессе созревания мРНК этого белка получаетсянесколько альтернативных форм, различающихся числом экзонов и, следовательно,размером белка. Молекулярные массы получающихся полипептидов для разныхживотных лежат в диапазоне от 14.0 до 21.5 кДа. У человека присутствуют три сплайсформы белка: с молекулярной массой 21.5 кДа (составлена из 7 экзонов), 18.5 кДа (из пятизкзонов) и 17.5 кДа (из двух экзонов).

Показана значительная степень гомологии междуаминокислотными последовательностями MBP (80–90%) среди млекопитающих. Так, ваминокислотных последовательностях MBP человека и быка имеются различияаминокислотных остатков лишь в нескольких положениях, в то время как MBP крысыотличается от MBP человека и быка положением 40 а. о. в середине полипептидной цепи(от 118 до 157 остатка) [97].MBP характеризуется необычайно высоким содержанием (~25%) основныхаминокислот (аргинин, лизин и гистидин), равномерно распределенных по всейполипептидной цепи, что и обусловливает очень высокую изоэлектрическую точку MBP(рI 11.5–13.0). Основная изоформа MBP с М 18.5 кДа подвергается несколькимпосттрансляционным модификациям, в том числе фосфорилированию, ацетилированиюN-конца, дезамидированию глутамина и аспарагина и деиминированию остатковаргинина.

Все это приводит к микрогетерогенности по заряду у молекул белка. Одним изглавных источников гетерогенности считается фосфорилирование и деиминирование.Такая микрогетерогенность зарядов может варьировать у различных индивидуумов взависимости от возраста и патологического состояния организма.

Так, например, MBPкомпонент 1 (С1) соответствует изоформе с максимальным положительным зарядом, вкоторой ни один из 19 аргининов не модифицирован, а MBP-компонент 8 (С8)соответствует изоформе, в которой 6 из 19 аргининов преобразованы в цитруллин.Интересно отметить, что количество компонента С8 значительно возрастает в тканяхмозга пациентов, страдающих РС [98]. Например, в головном мозге взрослого человека20% от общего количества MBP существует в С8-изоформе, при РС количество этойизоформы возрастает до 45%, а при остром склерозе Марбурга доходит до 80% и выше39[99]. В последнем случае у MBP 18 из 19 остатков аргинина подвергаются модификации.Чрезвычайно важный эффект деиминирования ОБМ был установлен коллективомавторов в работе [100].

Они показали, что в форме С8 участок V83-T92 теряет своюспиральную структуру, что приводит к его выпетливанию из билипидного слоя иповышенной чувствительности к протеолизу, что делает его гораздо более доступнымкомпонентам иммунной системы [101]. Потеря положительного заряда также приводит кповышенной чувствительности МВР к протеазам. Установлено, что при деиминированииболее чем 7 положительно заряженных остатков аргинина молекула МВР становитсякрайне чувствительна к протеолизу катепсином D [102]. Аналогичные результаты былиполучены в случае деградации МВР матриксной металлопротеиназой-3 (MMP-3) [103].Еще одна протеаза, по-видимому вовлеченная в процесс протеолиза и презентации МВР,это трипсин-4 [104]. Кроме того, при рассеянном склерозе и EAE в протеолизе MBP иобразовании иммуногенных пептидных эпитопов участвуют кальпаин [105], а также рядматриксных металлопротеиназ [106].

Интересно отметить, что МВР также способен кавтокаталитическому разрушению, что может быть альтернативным механизмом егопрезентации иммунной системе [107]. Авторы в очередной раз отмечают, чтодеиминированный МВР С8 легче подвергается самодеградации, в то время какприсутствие липидов, наоборот, стабилизирует белок.Рисунок 11. Аминокислотная последовательность MBP, иммунодоминантные T-клеточные (оранжевыйцвет) и B-клеточные (коричневый цвет) эпитопы и сайты протеолиза: Abz – каталитическими антителами(абзимами), CatD – катепсин D, MMP-3 – матриксная металлопротеиназа 3, MMP-9 – матрикснаяметаллопротеиназа-9, Tryp4 – трипсин-4, ACat – автокаталитическое расщепление, LP – лизосомныепротеазы.

Адаптировано из [108].Роль протеасомы в развитии РС и EAEКак уже упоминалось ранее, убиквитин-протеасомная система участвует врегуляции множества клеточных процессов, поэтому логично было бы предположить, чтоизменения в каталитической активности и субстратной специфичности протеасомывлияют на многие процессы, протекающие при развитии воспаления: передачу сигналацитокинами, пролиферацию клеток иммунной системы, уничтожение дефектных и40вредоносных белков, презентацию антигена на MHC I. Иммунопротеасома обуславливаетподдержание белкового гомеостаза в условиях окислительного стресса, вызванногодействием интерферонов на клетку [109].

Недавно было показано, что иммунопротеасомаучаствует в продукции цитокинов и дифференциации T-клеток [53]. У экспериментальныхживотных, нокаутных по иммуносубъединицам протеасомы, меняется репертуар Тклеточных рецепторов, количество CD8+ Т-клеток и их способность к дифференциации, иуровень продукции провоспалительных цитокинов [110] . Кроме того, у мышей,нокаутных по β1i, наблюдалось замедленное развитие и созревание B-клеток, проблемы спродукцией определенных изотипов антител и активацией дендритных клеток.

Авторысвязывают эти изменения с пониженным уровнем продукции фактора транскрипции NFκB в результате изменений в субстратной специфичности протеасомы [111]. NF-κBобразуется при протеолизе его предшественника IκB протеасомой, транслоцируется вядро и активирует ряд генов, многие из которых так или иначе вовлечены в работуиммунной системы.Известно, что под действием провоспалительных цитокинов в клетках различныхтипов повышается уровень экспрессии иммуносубъединиц протеасомы.

При развитиирассеянного склероза содержание иммунопротеасомы и регулятора PA28αβ увеличиваетсяпо сравнению с нормой во многих типах клеток: олигодендроцитах, астроцитах,макрофогах, микроглии и инфильтрирующих лимфоцитах [112]. У мышей линииC57BL/6, иммунизированных MOG35-55, в острой фазе ЕАЕ в головном мозгуувеличивалось содержание всех трех иммуносубъединиц протеасомы и регулятораPA28αβ, а в хронической фазе уменьшалось содержание конститутивных субъединиц посравнениюснеиммунизированнымимышами[113].Увеличениесодержанияиммуносубъединиц протеасомы в головном мозге при ЕАЕ наблюдалось также у крыслинии LEW-1N, иммунизированных MOG1-125 [114].Об участии иммунопротеасомы в презентации аутоантигенов аутореактивным CD8+Т-клеткам при РС косвенно свидетельствуют данные, полученные в работе [112].

Поддействием иммунопротеасомы, содержащей мутантную форму β1i иммуносубъединицы –HH60, при гидролизе MBP in vitro образовывалось пониженное количество эпитопаMBP111-119. Этот эпитоп презентируется на MHC I гаплотипа HLA-A*02, и специфичные кнему CD8+ T-клетки присутствуют в крови больных РС. Кроме того, у пациентов с РС,имеющих данный гаплотип HLA, мутантная форма β1 иммуносубъединицы HH60встречается значительно реже, чем в контрольной популяции с данным гаплотипом HLA.Это позволяет предположить, что пониженный риск развития PC у субъектов с HLA-A*02иHH60какминимумчастичнообусловлен41пониженнымколичествомиммунодоминантного эпитопа MBP111-119 в олигодендроцитах и антиген-презентирующихклетках [112].Современные подходы к терапии рассеянного склерозаЛечение РС остается одной из наиболее серьезных проблем современной медицины,хотя достигнутый в последние годы существенный прогресс в понимании механизмовразвития заболевания и его патогенеза позволил создать ряд эффективных подходов втерапии данного аутоиммунного заболевания.

Если ранее терапия пациентов с РСсводилась лишь к попыткам купирования обострений заболевания и проведениюсимптоматического лечения, то к настоящему времени появились пути прямоговоздействия на течение болезни.На сегодняшний день в терапии PC используются несколько типов препаратов:1) Глатирамера ацетат, Copaxone (GA) - это полипептид длиной 40-100 а.о.,включающий в себя случайную комбинацию аланина, лизина, глутамата и тирозина всоотношении 4.5:3.6:1.5:1 соответственно [115].

Структурно Copaxone имитируетположительно заряженный иммунодоминантный фрагмент MBP. Действие Copaxoneпредположительно состоит в конкуренции с фрагментами основного белка миелина засвязывание с молекулами ГКГС класса II DR, а также в индукции регуляторных Т-клеток(тип Tх2/3), секретирующих противовоспалительные цитокины ИЛ-4, ИЛ-10 инейротрофический фактор головного мозга.2)Препаратынаосновеинтерферона-βкоторыйинициируетрядантипролиферативных и иммуномодулирующих реакций [116].3) Митоксантрон [117] – ингибитор топоизомеразы II типа, обладающий общимиммуносупрессорным эффектом. Применяется достаточно редко из-за большогоколичества побочных действий.4) Моноклональные антитела, направленные против определенных молекул,участвующих в патогенезе заболевания.

Natalizumab – моноклональное антитело кинтегринам α4β1. Связываясь с интегринами, блокирует адгезию мононуклеарных клетокс не охарактеризованными рецепторами на поверхности стромальных эндотелиальныхклеток [118]. Это приводит к предотвращению миграции аутореактивных лимфоцитовчерез ГЭБ и в воспаленные ткани. Rituximab - антитело к рецептору CD20, содержащеесяна мембране зрелых В-клеток [118, 119]. Терапия препаратом Rituximab приводит ксистемному влиянию на продукцию антител, цитокиновую сеть, презентацию антигена Вклетками, активацию Т-клеток и макрофагов [120-124]. Еще несколько моноклональныхантител для терапии РС в настоящее время проходят клинические испытания [125].425) Перорально применяющиеся иммуномодулирующие препараты, изменяющиетечение PC.

Fingolimod (FTY720) - ингибитор SP1-ассоциированных G-опосредованныхрецепторов, предотвращает миграцию лимфоцитов в ЦНС [126]; Teriflunomide ингибитор пролиферации T клеток [126]; Диметил фумарат (Tecfidera, BG-12) индуцирует продукцию цитокинов Th2 типа [127-129].Тем не менее, стоит отметить, что вопреки впечатляющему массиву клинических,иммунологических и биохимических данных, а также частично изученным молекулярныммеханизмам, лежащих в основе возникновения и развития заболевания, на сегодняшнийдень не существует препарата, способного полностью остановить патологическиепроцессы при РС. Современные методы терапии РС являются не слишком эффективны вотношении прогрессирующих форм рассеянного склероза.

Многие из них обладаютвыраженными побочными действиями, в частности, общей иммуносупрессией. Крометого, все использующиеся в настоящее время подходы к терапии направлены на то, чтобызамедлить прогресс заболевания, а способы вызвать ремиелинизацию и регенерациюклеток ЦНС при РС в настоящий момент сильно ограничены [130]. В связи с этимактуальной проблемой остается поиск новых терапевтических мишеней и разработкаальтернативных методов терапии РС. Некоторые из них в настоящее время активноизучаются и проходят испытания на лабораторных животных с экспериментальноймоделью рассеянного склероза.

Перспективные подходы к терапии РС перечислены ниже.1) Селективная элиминация аутореактивных В-клеток при помощи иммунотоксинов.Молекулы иммунотоксинов состоят из двух ключевых фрагментов: сигнальнойпоследовательности адресной доставки к клетке-мишени и действующей части,приводящей к убийству клетки [131]. В качестве сигнальной последовательности могутвыступать любые молекулы, имеющие аффинность к белкам, экспонированным наповерхности клетки: антитела, Fab фрагменты антител, гормоны, цитокины, клеточныефакторы,вслучаетерапииаутоиммунныхзаболеваний,последовательности,специфичные для поверхностных Т- или В-клеточных рецепторов [131, 132].