Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации, страница 5

Однако, несмотря на варьирование концентрации и порядкавнесения ДМСО как криопротектора в суспензию клеток, времени выдерживания клеток вего присутствии в разных температурных режимах, все указанные способы характеризуютсяотносительно невысоким уровнем жизнеспособности клеток (максимально ~60-65%) послеразмораживания из-за деструктивного воздействия на клетки применяемого ДМСО. Все этиспособы дороги ввиду необходимости использования энергоёмкого и дорогостоящегокриогенного оборудования, обеспечивающего поддержание температур жидкого азота.23Кроме того при хранении образцов в жидком азоте существует необходимость егопериодического добавления в ёмкости для хранения клеток из-за его испарения, чтоприводит, таким образом, к дополнительным экономическим затратам.В этой связи более привлекательными являются способы криоконсервации клетокфототрофных микроорганизмов, которые используют замораживание клеток и их хранениепри температуре более высокой, чем температура жидкого азота.Известен способ криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов, согласнокоторому их замораживание проводят при температуре -20оС или -60оС или -80оС вприсутствии криопротектора (20% метанола или 5-10% ДМСО) и хранят при этих жезначенияхтемпературыкриоконсервациитемпературы[67,клетокжидкого68].являетсяазота,Несомненнымиспользованиепозволяющихпреимуществомтемпературприменятьболееэтогоспособасущественнопростоеивышедешёвоеоборудование, но огромным недостатком этого способа, как и ранее описанных,сдерживающим его применение, является использование токсичных криопротекторов,обеспечивающих частичное сохранение клетками их жизнеспособности непосредственнопосле размораживания и сохранение жизнеспособности после 2 лет хранения ниже уровня,характерного для клеток, замороженных без криопротектора.Проведение иммобилизации клеток фототрофных микроорганизмов путём включенияих в нетоксичную полимерную матрицу, состоящую из материала, способного проявлятьсвойства криопротектора, перед их криоконсервацией служит альтернативой тем способам, вкоторыхиспользуютсяпредусматривающиецитотоксичныетакуюкриопротекторы.иммобилизациюпередВэтойсвязикриоконсервациейспособы,особеннопривлекательны для их применения на практике.Известенспособкриоконсервации,вкоторомпроводитсяпервоначальноиммобилизация клеток диатомовых микроводорослей Haslea ostrearia в Са-альгинатныйгель, затем осуществляется пропитывание гранул раствором 0,7 М сахарозы, используемой вкачестве криопротектора, и их высушивание в потоке стерильного воздуха, замораживаниевысушенных образцов гранул при -80оС и перенос их в среду жидкого азота с последующимхранением при температуре жидкого азота [69].

Такой способ криоконсервации клеток,комбинирующий иммобилизацию клеток перед их криоконсервацией с двухстадийнымзамораживанием,междукоторымиещёиспользуетсяивысушиваниегранулсиммобилизованными клетками в присутсвии криопротектора, обеспечивает 77%-выживаниеклеток. Однако культивирование полученных таким образом образцов клеток фототрофныхмикроорганизмов сопровождается быстрым бактериальным и дрожжевым заражениемвследствие присутствия в них сахарозы. Кроме того, к недостаткам этого способа24криоконсервации относится его многостадийность и, соответственно, длительность изатратность (по времени, энергии, труду) самого процесса.Отказотстадиивысушиванияиммобилизованныхклеток,использованиядополнительного (помимо самой матрицы носителя) криопротектора, а также отдвухстадийного метода замораживания, существенно упростил бы процесс криоконсервациии сделал его более технически и экономически привлекательным.Так,известенмикроорганизмовспособкриоконсервации,иммобилизуютметодомприкоторомвключениявклеткифототрофныхСа-альгинатныйгельспоследующим замораживанием и хранением при температуре -20±2°C [70].

Для этоговыращивают клетки фототрофных микроорганизмов, в частности, цианобактерий RivulariaaquaticaилиGloeotrichiaechinulata,отделяютихоткультуральнойжидкостицентрифугированием и ресуспендируют в стерильном 6% растворе альгината натрия, чтобыполученную суспензию по каплям внести в 100 мМ раствор СаСl2 с целью формирования внём в течение 1 ч сферических гранул Са-альгинатного геля, содержащих включённые в негоклетки и имеющих диаметр 4 мм. Далее гранулы отделяют от раствора хлорида кальция,промывают стерильной дистиллированной водой и сушат в потоке стерильного воздуха(скорость потока воздуха – 0,45 м/с) в течение 30 мин, а затем помещают на хранение вгерметично закрытой ёмкости при температуре -20±2°C.Способ характеризуется несомненной привлекательностью в плане использованиясущественно более высоких температур в сравнении с жидким азотом, который требуетприменения дорогостоящего оборудования, и, кроме того, сам процесс замораживанияосуществляется в одну стадию, а не при использовании двухстадийного температурногорежима.

Последнее обстоятельство важно, с точки зрения потенциально возможногомасштабирования процесса, однако при хранении в течение 1 года образцов, полученныхтаким способом, остаточный уровень жизнеспособности у клеток составляет для разныхкультур не более 47-49%. Такой низкий уровень выживания клеток свидетельствует о том,что Са-альгинатный гель не обеспечивает в нужной мере роль криопротектора, и этоявляется одним из основных недостатков этого способа, существенно ограничивающихвозможность его использования на практике.В этой связи огромен интерес к таким методам иммобилизации клеток фототрофныхмикроорганизмов, которые позволили бы не только использовать их для получениявысококонцентрированных инокулятов для их применения в процессах накоплениябиомассы при очистке разных по химическому составу сточных вод, но и позволяли быхранитьихвтечениепродолжительноговременибеззначительныхпотерьжизнеспособности клеток в условиях, не требующих применения какого-либо особо25специального низкотемпературного оборудования.

В этом случае идея применения для этихцелей криогеля поливинилового спирта (ПВС), известного своей способностью при егоиспользовании в качестве носителя для иммобилизации клеток бактерий, дрожжей и спормицелиальных грибов, обеспечивать не только сохранность высокой метаболическойактивности клеток, но и их жизнеспособности на высоком уровне в течение длительноговремени при хранении [71], становится актуальной и привлекательной для её реализации наклетках фототрофных микроорганизмов.1.3 Предобработка биомассы фототрофных микроорганизмов для дальнейшегополучения различных биопродуктовДляэффективноймикроорганизмоввтрансформацииразличныеполученнойбиотехнологическиебиомассыпродуктыфототрофныхнеобходимаеепредварительная дезинтеграция и обработка, способ осуществления которой выбирается,исходя из данных о ее биохимическом составе.В настоящее время исследователи научились варьировать биохимический составфототрофных микроорганизмов путем изменения условий культивирования, в частности,путем лимитирования клеток в процессе их культивирования по источникам азота и фосфора[17, 18].

Так можно получать повышенное содержание липидов или углеводов в биомассеклеток фототрофных микроорганизмов, которые могут быть использованы для полученияразличных коммерчески значимых продуктов (биодизеля, биоэтанола, биобутанола, метана,ацетона, водорода, органических кислот, микробных полимеров).Кроме того, после экстракции липидов микроводорослей для получения биодизеля,оставшийся дебрис клеток, содержащий преимущественно углеводы и белки, также можетбыть сырьем для различных биотехнологических процессов при условии проведенияэффективной его гидролитической предобработки [72].Очевидно, что желаемый продукт и предполагаемый продуцент также определяютвыбор способа предобработки биомассы, поскольку необходимо руководствоваться даннымио субстратной специфичности штамма-продуцента конечного продукта, оптимальнойконцентрации питательных веществ, которая должна быть в среде, необходимости введениядополнительных источников питания, предпочтении определенныхфизико-химическиххарактеристик среды (вязкость, рН).

При этом необходимо свести к минимуму иконтролировать возможное появление токсичных для клеток микроорганизмов веществ,ингибирующих их метаболическую активность.В целом для предобработки биомассы микроводорослей применяются те же основныеподходы, что и для других видов возобновляемого сырья: физические (механическая26деструкция, термолиз, ультразвуковое воздействие, замораживание), химические (кислотнаяи щелочная предобработка, использование ионных жидкостей), ферментативные [73-75].Физическиеспособыдезинтеграциииспользуютсядлядеструкцииклетокмикроводорослей с целью получения липидов [73, 76], однако, как самостоятельные методы,неэффективны для гидролиза углеводных компонентов биомассы с целью получениявосстанавливающих сахаров (ВС), и в этом случае могут применяться в комбинации скислотным или ферментативным гидролизом [77].Кислотный гидролиз обычно проводится в присутствии неорганических кислот иявляется наиболее распространенным методом. Следует отметить, что, несмотря на быстротупроведения процесса и дешевизну используемого катализатора (как правило, H2SO4 и HCl),кислотный гидролиз имеет существенные недостатки, связанные с необходимостьюиспользования коррозионностойкого оборудования, и образованием большого количествапобочных продуктов [78].