Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М.В. ЛОМОНОСОВАХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиМАМЕДОВА Фахрия Тахир кызыРАЗЛИЧНЫЕ ПОДХОДЫ К НАКОПЛЕНИЮ БИОМАССЫМИКРОВОДОРОСЛЕЙ CHLORELLA VULGARISИ К ПРОЦЕССАМ ЕЁ БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)Диссертацияна соискание учёной степеникандидата химических наукНаучный руководитель:профессор, д.б.н., Ефременко Е.Н.МОСКВА - 20151СОДЕРЖАНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ6ВВЕДЕНИЕ8ГЛАВА I.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ141.1 Биомасса фототрофных микроорганизмов как перспективный сырьевойисточник для биотехнологических процессов1.2 Хранение культур фототрофных микроорганизмов201.3 Предобработка биомассы фототрофных микроорганизмов для дальнейшегополучения различных биопродуктов1.4 Трансформация биомассы фототрофных микроорганизмов в полупродукты длясинтеза биоразлагаемых полимеров1.4.1 Органические кислоты – мономеры для получения биоразлагаемыхполимеров1.4.2Полигидроксиалканоаты–микробныеполимеры14дляполучениябиоразлагаемых композиционных материалов26303440ГЛАВА II.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ442.1 Материалы442.1.1 Химические реактивы442.1.2 Приборы452.1.3 Микроорганизмы462.1.4 Источники углеводсодержащего сырья, использованного в работе462.2. Методы472.2.1 Культивирование клеток различных микроорганизмов472.2.2 Иммобилизация микроорганизмов в криогель поливинилового спирта482.2.3 Анализ состава биоорганических компонентов биомассы клетокмикроорганизмов492.2.3.1 Определение сухого веса (влажности) биомассы клеток микроорганизмов492.2.3.2 Определение содержания липидов502.2.3.3 Определение содержания белков502.2.3.4 Определение содержания углеводов512.2.3.4.1 Определение содержания целлюлозы в биомассе микроводорослейС.

vulgaris2.2.3.4.2 Определение содержания крахмала в биомассе микроводорослейС. vulgaris251512.2.4 Определение концентрации внутриклеточного АТФ биолюминесцентнымметодом2.2.5 Проведение и оценка эффективности гидролиза клеток микроводорослейC. vulgaris51532.2.5.1. Проведение кислотного гидролиза532.2.5.2 Проведение ферментативного гидролиза542.2.6 Получение органических кислот552.2.7 Биосорбция клеток микроводорослей C. vulgaris552.2.8 Получение метана562.2.9 Получение пиролизной нефти562.2.10 Получение ПГА562.2.11 Определение ХПК572.2.12 Определение концентрации ВС572.2.13 Определение концентрации глюкозы572.2.14 Определение концентрации органических кислот572.2.15 Определение содержания ПГА592.2.16 Определение концентрации продуктов трансформации сахаров в кислотныхгидролизатах биомассы микроводорослей С.

vulgaris2.2.17 Оценка токсичности гидролизатов биомассы микроводорослей C. vulgaris сиспользованием иммобилизованных клеток фотобактерий P. phosphoreum59592.2.18 Определение кинетических параметров процессов60ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ623.1 Исследование процесса накопления биомассы клеток микроводорослейC. vulgaris в сточных водах разного состава3.1.1 Культивирование свободных клеток микроводорослей С. vulgaris в сточныхводах3.1.2 Влияние иммобилизации клеток микроводорослей C. vulgaris на процесснакопления их биомассы3.2 Выбор способа гидролиза полисахаридов, входящих в состав биомассымикроводорослей С.

vulgaris3.2.1 Неферментативные способы предобработки биомассы микроводорослейC. vulgaris3.2.2 Ферментативная обработка биомассы микроводорослей C. vulgaris36262677981893.2.3 Сравнительный анализ эффективности различных способов предобработкибиомассы микроводорослей C. vulgaris1013.3 Трансформация ферментативных гидролизатов биомассы микроводорослейC. vulgaris в органические кислоты – мономеры для получения биоразлагаемых105полимеров, и биополимеры - полигидроксиалканоаты3.3.1ПолучениебиокатализаторовмолочнойввидеифумаровойиммобилизованныхкислотвсиспользованиемкриогельПВСклеток106мицелиальных грибов вида Rhizopus oryzae3.3.1.1 Получение молочной кислоты с использованием иммобилизованногобиокатализатора (ИБК) на основе клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae106F-8143.3.1.2 Получение фумаровой кислоты с использованием ИБК на основе клетокмицелиального гриба Rhizopus oryzae F-10321113.3.2 Получение янтарной кислоты с использованием биокатализатора в видеиммобилизованных в криогель ПВС клеток бактерий Actinobacillus succinogenes114B-101113.3.2.1 Характеристики процесса получения ЯК под действием свободных клетокбактерий A.

succinogenes В-101113.3.2.2 Разработка биокатализатора в виде иммобилизованных в криогель ПВСклеток бактерий A. succinogenes В-10111и исследование его свойств3.3.2.2.1 Оптимизация состава ИБК на основе клеток бактерий A. succinogenes,включенных в криогель ПВС3.3.2.2.2Исследованиеосновныхфункциональныхи115118118каталитическиххарактеристик разработанного ИБК на основе клеток бактерий A. succinogenes,120включенных в криогель ПВС3.3.2.2.3Трансформацияферментативныхгидролизатовбиомассымикроводорослей C.

vulgaris в ЯК под действием ИБК на основе клеток бактерий125A. succinogenes, включенных в криогель ПВС3.3.3 Использование ферментативных гидролизатов биомассы микроводорослейC. vulgaris в качестве субстрата для накопленияполигидроксиалканоатов129бактериями Cupriavidus necator В-86193.4 Оценка научно-практического потенциала полученных в данной работерезультатов3.4.1 Определение возможности и эффективности использования разработанного4139139способа иммобилизации клеток микроводорослей С. vulgaris в отношении клетокразличных фототрофных микроорганизмов3.4.2 Трансформация различного возобновляемого углеродсодержащего сырья вЯК под действием ИБК, разработанного на основе иммобилизованных клеток142бактерий A.

succinogenes3.4.3 Подходы к утилизации биокатализаторов в виде иммобилизованных клетокмицелиальных грибов, использованных в процессах получения органических144кислот из ферментолизатов биомассы микроводорослей C. vulgaris3.5 Биотехнологический комплекс для накопления биомассы микроводорослей впроцессе очистки сточных вод и ее последующей трансформации в органические153кислоты и ПГАВЫВОДЫ157СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1595СПИСОК СОКРАЩЕНИЙАТФ – аденозинтрифосфатАДФ – аденозиндифосфатБМ – биомассаВКПМ – Всероссийская Коллекция Промышленных МикроорганизмовВС – восстанавливающие сахараГЛ – глюкозаДМСО – диметилсульфоксидИБК – иммобилизованный биокатализаторИБХФ – Институт Биохимической Физики им. Н.М. ЭмануэляИЖ – ионные жидкостиМГУ – Московский государственный университет имени М.В.

ЛомоносоваМК – молочная кислотаП ИБК – продуктивность иммобилизованного биокатализатора, г ЯК(МК,ФК)/ч/кг ИБКПВС – поливиниловый спиртПГА – полигидроксиалканоатПП ИБК – период полуинактивации иммобилизованного биокатализатора, чФК – фумаровая кислотаХПК – химическое потребление кислородаЦСО – целлюлозосодержащие отходыЦСС – целлюлозосодержащее сырьёЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислотаЯК – янтарная кислотаTRIS - трис(гидроксиметил)аминометан[Bmim]Cl – 1-бутил-3-метилимидазолий хлоридСБМ – концентрация биомассы, г сух. в-в/лСБМ0 – исходная концентрация биомассы, г сух.

в-в/лCВС – концентрация восстанавливающих сахаров, г/лСВС0 - исходная концентрация восстанавливающих сахаров, г/лCГЛ – концентрация глюкозы, г/лСГЛ0 – исходная концентрация глюкозы, г/лСИБК - концентрация иммобилизованного биокатализатора (по сухим веществам), г/лСПГА – концентрация полигидроксиалканоатов, г/лCУГЛ – концентрация углеводов, г/л6СЯК(МК,ФК) макс – максимальная концентрация янтарной (молочной, фумаровой) кислоты, г/лQС – продуктивность процесса по биомассе (скорость накопления биомассы),г(мг) сух. в-в/л/ч(сут)QВС – средняя скорость накопления восстанавливающих сахаров, г/л/чQГЛ – средняя скорость накопления глюкозы, г/л/чQПГА – средняя скорость накопления полигидроксиалканоатов, мг/л/чQЯК(МК,ФК) – продуктивность процесса по янтарной (молочной, фумаровой) кислоте, г/л/чV0 - начальная скорость гидролиза углеводов до восстанавливающих сахаров, г/л/сутYВС – выход восстанавливающих сахаров, % от общего количества углеводовYГЛ – выход глюкозы, % от общего количества углеводовYЯК(МК,ФК)/БМ - степень конверсии биомассы в янтарную (молочную, фумаровую) кислотуYЯК(МК,ФК)/ВС – степень конверсии потребленных восстанавливающих сахаров в янтарную(молочную, фумаровую) кислотуYЯК(МК,ФК)/УГЛ - степень конверсии углеводов в янтарную (молочную, фумаровую) кислоту – удельная скорость роста клеток, ч-1 или сут-1Δ СВС – потребление восстанавливающих сахаров, %Δ СГЛ – потребление глюкозы, %7ВВЕДЕНИЕВ современном мире в стадии масштабно внедряемых или только разрабатываемыхнаходитсябольшоеколичестворазличныхтехнологийиспользованиябиомассывэнергетических и сырьевых целях.

Поиски продуктивных видов биомассы для полученияэнергии выдвигают в разряд перспективных источников фототрофные микроорганизмы.При разработке таких биотехнологических процессов важно не только учитыватьвозможность получения различных целевых продуктов из используемой биомассы, но иорганизовать безопасное производство с минимальной нагрузкой на окружающую среду.Этим требованиям вполне отвечает биомасса микроводорослей.По состоянию на 2010 г. мировое производство биомассы микроводорослейсоставляло более 7000 т/год, основная масса которого приходилась на США, Китай, Индию,Японию, Германию, Австралию, Израиль и Тайвань. Такие микроводоросли, как Chlorellavulgaris, Dunaliella salina, Haematococcus pluvialis, Crypthecodinium cohnii и Botrrycoccusbraunii используются в пищевой и фармацевтической промышленности, в производствекосметики, биотоплива, кормов для животных и др.