Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации, страница 4

Часто азот в сточных водах представлен соединениями аммония,17которые могут в высоких концентрациях значительно ингибировать рост микроводорослей[31, 32]. Кроме того, сточные воды могут также содержать различные химические (кадмий,ртуть и цинк) [33] или биотические ингибиторы [34] развития микроводорослей. В сточныхводах пищевой промышленности органические вещества могут стимулировать рост другихмикроорганизмов, например бактерий, которые будут конкурировать с микроводорослями заусвоение необходимых питательных веществ.Поскольку вопрос об использовании сточных вод для роста клеток фототрофов оченьактуален, то в настоящее время много научных коллективов вовлечено в исследованиепроцессов культивирования биомассы фототрофных микроорганизмов с использованиемсточных вод различных производств (Таблица 2).

Однако все они отмечают тот факт, что,несмотря на то, что микроводоросли способны расти в самых разнообразных условиях, некаждый штамм фототрофных микроорганизмов способен адаптироваться к росту на сточныхводах.Как правило, на сточных водах культивируют штаммы, способные к миксотрофномуросту, поскольку в этом случае возможна параллельная утилизация неорганических иорганических источников углерода. Поскольку различные сточные воды содержат,соответственно,иразличныеисточникиуглерода,тонеобходимоосуществлятьпредварительный скрининг культур, культивирование которых возможно на имеющейсясточной воде. Согласно данным, имеющимся в литературе, наиболее адаптируемыми кразличным условиям окружающей среды, являются микроводоросли рода Chlorella,Botryococcus, Scenedesmus [28], при этом представители рода Chlorella обладаютнаилучшими показателями по скоростям накопления биомассы (Таблица 2).Одним из решений проблем адаптации клеток микроводорослей к различнымсточным водам может быть использование иммобилизованного инокулята культуры дляинтенсификации процесса накопления биомассы.

Иммобилизация клеток микроводорослей иих использование на первоначальном этапе культивирования может обеспечить возможностьрегуляции их концентрации и повышения их резистентности к содержанию токсичныхкомпонентов, высоким концентрациям органических или неорганических веществ.Обзор информационных источников показал, что некоторые исследователи ужепровелипервыеэкспериментыпокультивированиюиммобилизованныхклетокмикроводорослей рода Chlorella на различных видах сточных вод (Таблица 3). В качественосителя для иммобилизации в основном использовались гели, главным образом Саальгинатый гель. Однако, несмотря на то, что клетки микроводорослей могли расти виммобилизованном виде, скорость их роста была тем не менее ниже скорости ростасвободных клеток в тех же условиях.18Таблица 2 – Скорость накопления биомассы клеток микроводорослей, выращенных всточных водахМикроводорослиИсточник сточных водСкорость накоплениябиомассы, мг сух.

в-в/л/cут2,6 г/м2/сут81[35][36]59[37]Модельные сточные воды,43[38]имитирующие бытовые90Бытовые стоки65Chlorella sp.Chlorella sp.,СсылкаМолочное производствоMicractinium sp.,Actinastrum sp.Chlorella sp.Chlorella vulgaris[39]Модельные сточные воды,93[40]Бытовые стоки62[41]Производство биогаза39[42]содержащие нонилфенолChlorella pyrenoidosaChlorella saccharophilaBotryococcus braunii23Производство ковров34Dunaliella tertiolecta28Pleurochrysis carterae33[43]СельскохозяйственныеScenedesmus sp.Scenedesmus obliguusСледуетстоки6[44]Бытовые стоки26[45]отметить,иммобилизованныхклетокчтовприведенныхмикроводорослейродаработахChlorellaпонакультивированиюсточныхводахиспользовались только бытовые или модельные сточные воды. Другие типы сточных вод неисследовались, снижение уровня ХПК в них не изучалось.Таким образом, очевидна необходимость дополнительных исследований в даннойобласти, апробация новых способов иммобилизации клеток и носителей, обеспечивающихболее высокие скорости накопления биомассы микроводорослей при использовании исходноиммобилизованных клеток в качестве инокулята.19Таблица 3 – Скорость накопления биомассы клеток микроводорослей рода Chlorella всточных водах при использовании в качестве инокулята иммобилизованных клеток тех жемикроводорослейСкоростьСточные водыНоситель длянакопленияиммобилизациибиомассы, мгСсылкасух.

в-в/л/cутМодельные, имитирующие бытовыеМодифицированная20[38]Модельные, имитирующие бытовые-[46]Модельные, имитирующие бытовые70Бытовые50Модельные, содержащие нонилфенолцеллюлозаСа-альгинатый гельМодельные, имитирующие бытовые(миксотрофные условия)[39]40[40]500[47]59БытовыеК-карагинанановый гель[41]60При этом следует отметить, что некоторые способы иммобилизации позволяютдлительно сохранять жизнеспособность клеток микроводорослей в случае подобнойнеобходимости и поэтому поиск метода получения иммобилизованного инокулята в видеклеток микроводорослей, сочетающего в себе решение этих двух задач (эффективноехранение и увеличение скорости накопления биомассы) является актуальным и обладаетбольшой практической значимостью.1.2 Хранение культур фототрофных микроорганизмовПоскольку, известно, что при хранении фототрофных микроорганизмов помимопотери клетками жизнеспособности также имеют место процессы популяционнойизменчивости, при этом доминантный фенотип замещается другими с измененнымиисходными свойствами и продуктивностью, происходит потеря клетками хранящейсякультуры приоритетных свойств [48], то весьма актуальными становятся вопросы, связанныесвозможностьюспециализированныхиспользованияколлекций,эффективныхспособовпроизводственныхихранениявусловияхнаучно-исследовательскихлабораторий клеток фототрофных микроорганизмов, представляющих коммерческийинтерес, в частности, в качестве источника биомассы, являющейся ценным возобновляемым20сырьём.

Одним из основных критериев применения того или иного способа хранения клетокфототрофных микроорганизмов является адекватный выбор условий их хранения,обеспечивающих длительное сохранение клетками своих популяционных характеристик имаксимально возможного уровня жизнеспособности.Известнофототрофныхнесколькоразличныхмикроорганизмоввспособов,позволяющихжизнеспособномисохранятьрепродуктивномклеткисостоянии(поддержание клеток на жидких и агаризованных средах, хранение в иммобилизованномвиде,лиофилизацияикриоконсервациясиспользованиемзащитныхсредикриопротекторов) [49-52]. При этом самым эффективным способом долгосрочного храненияразличных фототрофных микроорганизмов на сегодняшний день считается криоконсевация.Этот способ состоит в переводе биологических объектов в состояние холодового анабиоза(замораживания)споследующимвозвратомихкметаболическойактивности(размораживания) в физиологически оптимальных условиях культивирования.

Согласнобольшинству известных способов криоконсервации фототрофных микроорганизмов, онаосуществляется путем замораживания клеток в различных условиях с последующим иххранением в замороженном состоянии [53, 54].Известно, что при глубоком замораживании биологических объектов могутпроисходить серьёзные, в том числе необратимые повреждения клеток за счёт повреждений,вызываемых формированием кристаллов льда как внутри, так и снаружи клеток,сопровождающихся их обезвоживанием и нарушением свойств клеточных мембран [53].Повышение концентрации электролитов в процессе замораживания приводит к изменениюконцентрации водородных ионов и нарушению кислотно-щелочного баланса.

Вследствиеобезвоживания локальное содержание солей в клетке достигает критической концентрации,оказывая негативное воздействие на структуру белков.Варьированиережимов«замораживания-оттаивания»клеток(температуразамораживания, температура оттаивания, скорости одного и другого процесса) можетповыситьэффективностьрезультатовкриоконсервацииклетокфототрофныхмикроорганизмов [54].В отношении температуры замораживания все известныесегодня способыкриоконсервации фототрофных клеток можно разделить на два основных типа:-способыкриоконсервацииклетокфототрофныхмикроорганизмов,предусматривающие хранение клеток при температуре жидкого азота,- способы, предусматривающие хранение клеток при температуре выше температурыжидкого азота.21Замораживание клеток до температуры жидкого азота сопровождается быстрымохлаждением образца, приводящим к резкому снижению его температуры.

Такое быстроеохлаждение минимизирует эффект концентрирования электролитов вне клетки, так какобразование льда протекает равномерно, но приводит к образованию большего еговнутриклеточного количества. Медленное охлаждение (до температуры -30÷-80оС) наоборотприводит к большей потере воды из клетки и к меньшему накоплению внутриклеточногольда, но при этом эффект концентрирования электролитов вне клетки значительноповышается. И тот, и другой режимы замораживания для эффективной криоконсервацииклеток предполагают применение и внесение в суспензию клеток криопротекторов –защитных агентов, которые, как правило, влияют на эластичность цитоплазматическоймембраны, связывают внутриклеточную воду и предотвращают чрезмерное обезвоживаниеклеток, снижают токсическое воздействие солей электролитов и препятствуют образованиюкрупных кристаллов льда в клетке или в непосредственной близости от клетки [55].Учитываявышесказанное,наиболеечастоприменяемымиспособамикриоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов являются те, в которых длямаксимального сохранения их жизнеспособности используют двухстадийный режимзамораживания суспензии клеток [56-58], при котором проводят первоначально медленноеохлаждение клеток до -30÷-140оС в присутствии какого-либо криопротектора, а затемзначительно более глубокое и быстрое замораживание клеток, перенося их в условиятемпературы жидкого азота.Так известен способ криоконсервации фототрофных клеток Chlamydomonas reinhardtiiс использованием режима двухстадийного замораживания, согласно которому суспензиюклеток ((2,2÷3,3)х106 кл/мл) первоначально замораживают до -55оС в присутствии метанола(2-10%), помещая далее замороженный материал в пары жидкого азота с температурой-170оС.

Жизнеспособность клеток при этом составляет 40-52,5% [59]. В другом варианте тогоже способа двустадийного замораживания в качестве криопротектора используется 10%раствор диметилсульфоксида (ДМСО) [60]. При этом первичное охлаждение ведётся дотемпературы -80оС, далее при этой температуре клетки выдерживаются 1,5 ч и погружаютсявжидкийазот.Согласноэтомувариантуспособакриоконсервации,клеткиC.

vulgaris могут храниться на протяжении 10-30 суток при -196оС. Однако длябиотехнологических процессов хранения и использования инокулята такой способ неподходит. Увеличение концентрации ДМСО, используемого в качестве криоконсерванта, до20% приводит к снижению уровня выживаемости клеток C. vulgaris [61]. Основныминедостатками данных способов являются: недостаточно высокая выживаемость клеток врезультатезамораживания/оттаиванияклеток,22необходимостьприменениясложнойаппаратурыдляпрограммируемогозамораживаниясуспензииклеток,применениецитотоксичных криопротекторов (метанола, ДМСО), требующих от персонала соблюденияособых мер предосторожности при работе с ними, а также быстрого освобождения клеток отэтих криопротекторов сразу же после их размораживания (например, центрифугированием,промываниемфизиологическимраствором,карбонатнымбуферомиповторнымцентрифугированием).Также в роли крипротекторов вместо ДМСО может применяться 5% растворглицерина [62], или даже смесь разных криопротекторов [63].

Клетки фототрофныхмикроорганизмовродовChlorella,NannochloropsisилиTetraselmisсохраняютжизнеспособность на уровне 50% от исходного уровня. При этом жизнеспособность клетокоценивается как процентное отношение скорости роста образца клеток до и послекриоконсервации. Остаточный уровень жизнеспособности у клеток (50%) не изменяется втечение 15 лет их хранения при -196оС. Достоинством данного способа является постоянныйостаточный уровень жизнеспособности, достигаемый при их криохранении. Однакоснижение жизнеспособности на 50% в сравнении с исходным уровнем является большимнедостатком способа. Кроме того, способ основан на методике замораживания сиспользованием сложной криогенной техники, а также использовании цитотоксичноговещества (ДМСО), от которого требуется быстро избавляться после размораживания клеток,и биодеградируемого пролина, провоцирующего контаминацию клеточного материала.Известен ещё целый ряд модификаций способа криоконсервации клеток фототрофныхмикроорганизмов с использованием режима двухстадийного замораживания и ДМСО вкачестве криопротектора, в которых клетки либо первоначально замораживают при скорости1оС в мин до -40оС, а потом переносят в жидкий азот, добавляя ДМСО в концентрации 1020% [64], либо клетки первоначально инкубируют 10 мин в присутствии 10% ДМСО, затемих замораживают до -80оС со скоростью -1оС/мин, после чего погружают в жидкий азот [65],либо клетки смешивают с раствором ДМСО до конечной его концентрации 10-15%,выдерживают 15 мин в темноте при комнатной температуре, затем замораживают соскоростью 3оС/мин до -40оС и после экспозиции при этой температуре в течение 10 минпогружают в жидкий азот [66].