Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации, страница 7

В последние десятилетия с развитием научныхпредставлений о влиянии условий культивирования на изменение биохимического состава30Таблица 5 – Результаты ферментативных способов предобработки биомассы микроводорослейМикроводоросли% углеводовв биомассеот сух. в-в**Chlorella vulgaris22,431Chlorellahomosphaera**ChlorellazofingiensisChlorellapyrenoidosa26Условия обработки биомассыФерментативный гидролиз 2,6 г сух. в-в биомассы/л (pH 4,8, 550C, 10 ч)под действием лизоцима (2 мг/г сух.

биомассы)Ферментативный гидролиз 2,6 г сух. в-в биомассы/л (pH 4,8, 550C, 10 ч)под действием целлюлазы (2 мг/г сух. биомассы)Последовательно 2 стадии:1) Дезинтеграция биомассы в шаровой мельнице2) Ферментативный гидролиз 100 г сух. в-в биомассы/л (цитратнофосфатный буфер (pH 4,8), 500С, 72 ч) под действием пектиназыA.aculeatus (1,88 г/г сух. биомассы)Последовательно 4 стадии:1) Промывка биомассы дважды 95% охлажденным этанолом2) Высушивание биомассы и растирание пестиком в ступке3) Замораживание биомассы при -200С4) Ферментативный гидролиз 100 г сух.

в-в биомассы/л (Na-ацетатномбуфер (pH 4,8), 500C, 24 ч) под действием ферментного комплекса изцеллюлазы T. reesei (10 Ед/г сух. биомассы), ксиланазы T. reesei (10 Ед/гсух. биомассы), амилазы Aspergillus awamori (10 Ед/г сух. биомассы)Последовательно 3 стадии:1) Промывка биомассы дважды дистиллированной водой2) Лиофилизация биомассы 24 ч3) Ферментативный гидролиз 20 г сух. в-в биомассы/л (Na-ацетатномбуфер (pH 4,6), 500C, 72 ч) под действием целлюлазы, иммобилизованнойна нановолокнистой мембране ПАН (полиактрилонитрил) (28 мгцеллюлазы/г ПАН)YВС(в т.ч.YГЛ), %Целевойпродукт,получаемый избиомассыСсылка**Липидыбиомассы[97]79Биоэтанол[75]24,5(23,3) *19,3(18,4) *62[77]-[98]МикроводорослиChlamidomonasreinhardti% углеводовв биомассеот сух.

в-в59,7Chlorococcumhumicola32,532Hydrodictyonreticulum62,9Условия обработки биомассыПоследовательно 2 стадии:1) Промывка биомассы водой2) Ферментативный гидролиз 50 г сух. в-в биомассы/л:-ожижение (pH 6,0, 900C, 30 мин) под действием α-амилазы Bacilluslicheniformis (1мг/г сух. биомассы)-осахаривание (pH 4,5, 550C, 30 мин) под действием глюкоамилазыAspergillus niger (40 мг/г сух. биомассы)Последовательно 4 стадии:1) Дезинтеграция биомассы ультразвуком (40 кГц, 25 мин)2) Высушивание биомассы при 600С 12 ч3) Измельчение биомассы в лабораторной дисковой мельнице4) Ферментативный гидролиз 10 г сух.

в-в биомассы/л (Na-ацетатномбуфер (pH 4,8), 400C, 11 ч) под действием целлюлазы Tricoderma reesei (20мг/г сух. биомассы)Последовательно 2 стадии:1) Промывка биомассы водопроводной водой, высушивание прикомнатной температуре2) Ферментативный гидролиз 80 г сух. в-в биомассы/л (pH 6,0, 340C, 48 чпод действием комплекса ферментных препаратов из Celluclast Conc BG(20 мг/г сух. биомассы), целлобиазы Aspergillus niger (10 мг/г сух.биомассы), глюкоамилазы A. niger (10 мг/г сух. биомассы)*- от сухой биомассы** - параметр не контролировалсяYВС, YГЛ – выходы ВС, глюкозы, % от общего количества углеводовТаблица 5 продолжениеЦелевойYВСпродукт,(в т.ч.Ссылкаполучаемый изYГЛ), %биомассы67[99]64,2Биоэтанол[100]**Молочнаякислота[101,102]биомассы микроводорослей интенсивно внедрялись проекты по конверсии липидов,входящих в ее состав, в биодизельное топливо [105].Однако в настоящее время в связи со значительным снижением цен на нефть достичьпоказателисебестоимостиполучаемыхбиотопливвсравненииссебестоимостьюаналогичных нефтепродуктов не представляется возможным.

В этой связи актуальнойявляетсяконверсиябиологическихмакромолекул,входящихвсоставбиомассыфототрофных микроорганизмов, в коммерчески значимые продукты с высокой стоимостью,в частности, направленные на импортозамещение зарубежных аналогов.К таким продуктам относятся органические кислоты (молочная, фумаровая, янтарная,яблочная,аспарагиновая)илимикробныебиополимеры(полигидроксиалканоаты,бактериальная целлюлоза, ксантан, пуллулан), которые могут использоваться для получениябиоразлагаемых композитных материалов (Рисунок 2).фумаровая кислота1,4 бутандиолянтарная кислота1,4 бутандиолянтарная кислотаполи (бутилен фумарат)поли (бутилен сукцинат)1,4 пропандиолполимер на основе (1,3-пропилен сукцината)OOHмолочная кислотаполилактидполигидроксиалканоатыРисунок 2 – Биоразлагаемые полимеры33В настоящее время спрос на пластик и изделия из него в мире превышает 200 млн.тонн и увеличивается с каждым годом [106]. После использования основная масса пластиков,производимых из нефти и природного газа, не подлежит биодеградации в условияхокружающей среды, что создает глобальные экологические проблемы и формирует стимул кускоренной разработке технологий получения природных полимеров из возобновляемогосырья при его глубокой переработке.

По своим характеристикам эти полимеры близки ксинтетическим, но при этом являются биосовместимыми и биоразлагаемыми, то естьполностью разлагающимися до углекислого газа и воды [107].Многие мировые компании (Coca-Cola, Procter & Gamble и др.) уже началипроизводить биоразлагаемые композиты из целлюлозосодержащих отходов с цельюизготовления тары для своей продукции.

Наиболее интенсивный рост наблюдается на рынкебиопластиков в Северной Америке, Японии и Европе. Объем производства биопластиковсегодня в мире оценивается в 2 млн т/г, а к 2017 г по прогнозам достигнет 6 млн т/г [108]. ВРоссии начат импорт таких биополимеров, тогда как производства не существует в видуотсутствия промышленных технологий по производству исходных материалов.1.4.1 Органические кислоты – мономеры для получения биоразлагаемых полимеровБиокомпозитные материалы на основе органических кислот перспективны, с точкизрения замены традиционных во всех областях, и находят все большее применение напрактике.

Например, композитные материалы на основе молочной кислоты (МК) нашлиприменение в производстве упаковки одноразового использования (пищевая упаковка), вмедицине (хирургические нити) [109, 110].Основным ограничивающим фактором выпуска конкурентоспособных биопластиковна основе полилактидов являются высокие затраты на её производство той степени чистоты,которая требуется для синтеза полимеров.БиотехнологическимгидролизатовразличныхпутемвидовМКможновозобновляемогополучатьсырьяизглюкозосодержащих(сахаро-,целлюлозо-икрахмалосодержащих отходов сельского хозяйства и пищевой промышленности) припомощи бактерий и мицелиальных грибов [111, 112].Использование молочнокислых бактерий рода Lactobacillus позволяет получать смесьD и L-формы МК (1:1) [113], а использование мицелиальных грибов рода Rhizopus позволяетполучать продукт преимущественно в виде L-формы [114].

Промышленных процессов сиспользованием таких грибов пока нет, хотя интерес к ним огромен, так как показано, что вотличие от бактериальных продуцентов клетки мицелиальных грибов R. oryzae способны34конвертировать в МК не только глюкозу, но и ксилозу с 60%-ным выходом за счет синтеза исекреции собственных ксиланаз [115].В большинстве случаев среды, содержание МК и полученные в результатекультивирования бактерий, представляют собой гидролизаты крахмалсодержащего сырья, укоторых есть достаточно высокая пищевая ценность.

В этой связи процесс получения МКдля производства биопластиков конкурирует с процессами, ориентированными напереработку исходного сырья в продукты, удовлетворяющие пищевые потребности людей инужды животноводства. Отсюда возникает интерес к другим источникам сырья дляполучения МК – прежде всего это целлюлозосодержащая биомасса [116, 117]. Однакоприсутствие разных природных ингибиторов синтеза белка в данном сырье негативно влияетна метаболическую активность клеток – продуцентов МК. В связи с этим актуальностьиспользования биомассы микроводорослей для получения МК только возрастает. Поэкспериментальным данным в этом направлении исследований пока что крайне мало [89,101, 102, 111].Фумаровая кислота (ФК) используется в производстве различных фармацевтическихпрепаратов, напитков, продуктов питания, кормов для животных, моющих средств,ненасыщенных полиэфирных, алкидных смол и печатных красок [118], кроме того ФКвместе с молочной и янтарной кислотами была определена в качестве одного из десятиосновных химических веществ, актуальность получения которых для синтеза биопластиковпутём биотехнологической конверсии биомассы различного типа крайне высока всовременном мире [119].Полимеры на основе фумаровой и янтарной кислот способны заменить традиционноиспользуемые полимерные материалы, например, для получения одноразовой посуды,поскольку обладают достаточно высокими прочностными характеристиками и при этомподвергаются биоразложению [120].Традиционные химические методы получения органических кислот трудоемки идорогостоящи из-за больших расходов и нестабильности применяемых металлсодержащихкатализаторов [121], поэтому актуальным представляется получение органических кислотбиокаталитическимспособом,прикоторомиспользуемыекатализаторыдешевые,применяются в меньших количествах и могут длительно применяться, если этоиммобилизованные биокатализаторы [122, 123].ФК является естественной органической кислотой, которая синтезируется в циклетрикарбоновых кислот [124] и присутствует во всех живых клетках, однако редкосекретируется в среду.

Продуцентом данной кислоты являются различные микроорганизмыродов Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, однако наиболее активны именно представители рода35Rhizopus. У этих клеток имеется способность продуцировать и секретировать ФК при ихэкспонировании в средах, содержащих различные сахара, в первую очередь, глюкозу[125].Так, среды, используемые для получения ФК, как правило, содержат глюкозу вконцентрации 50–100 г/л, при этом в ходе ферментации проводится нейтрализация средыCaCO3 или раствором KOH для поддержания значения рН, благоприятного дляфункционирования клеток.Что касается янтарной кислоты (ЯК), то она является полупродуктом для синтезацелого ряда конечных продуктов, в частности, биопластиков [126-128]. ЯК также широкоиспользуется в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки, подкислителя иконсерванта, в последние годы она стала применяться в косметологии [129].В настоящее время ЯК получают методом химического синтеза из малеиновойкислоты или ее ангидрида, с использованием дорогостоящего ванадиевого катализатора[130].Наиболее перспективным представляется биотехнологический процесс получения ЯК,при котором произведенный продукт характеризуется высокой чистотой [131].

Наиболееэффективным процессом биокаталитического получения ЯК и ее солей является анаэробноесбраживание сахаров, в частности, глюкозы, с формированием целевого продукта ввосстановительной части цикла трикарбоновых кислот [132].Продуцентами ЯК могут быть различные клетки бактерий (Actinobacillus succinogenes,Anaerobiospirillum succiniciproducens, Escherichia coli, Mannheimia succiniciproducens) [131] идрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces rouxii, Yarrowia lipolytica) [133, 134,135], однако наиболее эффективными являются клетки Actinobacillus succinogenes, которыеспособны конвертировать в ЯК не только глюкозу, но и целый ряд других сахаров [136, 137],и даже глицерин [138].